武漢大學張先正Nat. Commun.：基于疫苗的納米系統用于啟動天然免疫和增強腫瘤免疫治療

【研究背景】

免疫治療釋放患者自身免疫系統在各種不可治愈腫瘤中取得了較好的臨床效果。免疫檢查點阻斷（ICB），特別是以程序性細胞死亡蛋白1或程序性細胞死亡蛋白1（PD1/PDL1）為靶點的藥物治療在黑色素瘤、非小細胞肺癌和三陰性乳腺癌（TNBC）的治療中取得了滿意的療效。盡管如此，但ICB治療在臨床試驗中面臨的一個主要問題是反應率極低。即使是黑色素瘤，一種最具免疫原性的腫瘤，只有20-50%的患者受益于ICB治療。據報道，由于微生物能夠引起強大和持久的免疫應答，因此被用于提高癌癥治療的治療反應率。然而，安全性問題是目前基于微生物治療的最大難題。例如，由細菌（如細胞因子釋放綜合征和感染）或病毒（主要是疲勞、發燒和寒戰）引起的不良反應，很大程度上限制了它們的臨床轉化能力。

【成果簡介】

近日，在微生物特性和適當的生物安全性的啟發下，武漢大學張先正教授團隊通過將Cd274的siRNA整合到商業化的人乳頭瘤病毒（HPV）L1（HPV16 L1）蛋白中，制備了一種基于疫苗的納米系統，用于特異性抑制腫瘤PDL1表達。受益于HPV疫苗的優點，這種siRNA負載的納米系統（siRNA@HPVP）具有良好的生物安全性，提高了抗腫瘤免疫治療的療效。HPV16-L1蛋白通過I型干擾素途徑激活先天免疫，與ICB聯合治療具有有效的抗癌作用。對于可切除和不可切除的乳腺腫瘤，納米系統可減少71%的腫瘤復發，延長67%的小鼠存活期。最重要的是，該納米系統在不同突變的腫瘤荷瘤小鼠中，治療響應率也非常高。這種基于疫苗的納米系統引發的強烈免疫刺激可能是一種顯著改善當前ICB免疫治療的方法。該文章近日以題為“A vaccine-based nanosystem for initiating innate immunity and improving tumor immunotherapy”發表在知名期刊Nature Communications上。

【圖文導讀】

圖一、siRNA@HPVP的作用原理和表征

（a）1097人類乳腺腫瘤和114個來自UALCAN的準癌組織腫瘤免疫調節相關基因的表達。

（b）CD3E/IRF7表達與TCGA乳腺腫瘤患者生存之間的相關性。

（c）siRNA@HPVP系統設計和功能過程的示意圖。

（d）三個siRNA序列（100 nmol mL^-1）沉默4T1細胞后Cd274轉錄的PCR分析。

（e）在HPVP與siRNA的不同質量比下，siRNA@HPVP的凝膠電泳。

（f）siRNA@HPVP的低溫透射電鏡圖像。

（g）流式分析在4T1細胞和4T1^Itga6-細胞中siRNA@HPVP的攝取。

圖二、體外抗原呈遞細胞（APCs）激活

（a）脾細胞對4T1細胞的體外殺傷作用（效應物-靶比值10:1）。

（b）用不同siRNA@HPVP形式（siRNA1@HPVP、siRNA2@HPVP或siRNA3@HPVP）、HPVP或新鮮培養基共同孵育24小時后，在CD11c⁺細胞共孵育成熟DC（CD80⁺CD86⁺）的FACS數據。

（c）不同處理后DCs中IFN-α和IFN-γ的轉錄豐度。

（d-e）FACS數據顯示巨噬細胞（CD11b⁺CD80^-）經過不同處理后6小時表型和活化比例。

（f）不同處理后RAW 264.7巨噬細胞培養液中細胞因子水平的變化。

圖三、siRNA2@HPVP的腫瘤聚集和抗腫瘤能力

（a）注射HPVP對4T1荷瘤小鼠體內腫瘤靶向能力的研究。

（b）用于評估PDL1抑制siRNA1@HPVP、siRNA2@HPVP和siRNA3@HPVP效果的離體免疫熒光圖像

（c）生物發光法原位檢測siRNA2@HPVP對4T1腫瘤治療后的先天免疫反應。

（d）對不同治療組在小鼠皮下乳腺腫瘤模型上的體內抗癌效果評估。

（e）FACS分析用于測量PBS或siRNA2@HPVP治療小鼠腫瘤中PDL1蛋白的表達。

（f）不同治療后Ki67腫瘤細胞的定量分析。

（g）不同治療后淋巴結內成熟DCs（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）和腫瘤浸潤性細胞毒T細胞（CD3⁺CD8⁺T細胞）的FACS數據。

（h）FACS分析法測定不同治療后腫瘤內M1/M2巨噬細胞比值。

（i）不同處理后12小時小鼠血清IFN水平的變化。

圖四、先天免疫的激活機制

（a）在腫瘤內注射3天后，用siRNA2@HPVP或aPDL1在4T1腫瘤中識別差異表達的基因。

（b）GeneMANIA用于預測免疫過程GO術語中差異基因之間的基因相互作用。

（c）KEGG濃縮分析siRNA2@HPVP治療引起的生物效應所涉及的途徑。

（d）不同治療方法對4T1腫瘤Tlr7、Cxcl9、Infb1、Ifngr1和Ifng基因轉錄豐度的PCR分析。

（e）siRNA2@HPVP激活先天免疫的可能機制的原理圖。

（f）瞬時表達TLR同型二聚體和ELAM-Luc報告質粒的HEK-293細胞證明siRNA2@HPVP介導的免疫反應與TLR7相關。

（g）抗IFNAR1抗體阻斷Ⅰ型IFN途徑抑制siRNA2@HPVP治療。

（h）用免疫熒光染色法定量分析不同治療方法對4T1腫瘤T-bet（左）和CD4（右）表達的影響。

圖五、可切除和不可切除腫瘤模型的治療效果

（a）評估siRNA2@HPVP治療的抗癌效果的不同腫瘤模型。

（b）活體生物發光圖像對原發性腫瘤切除后4T1腫瘤的復發和轉移的示蹤。

（c）原發性腫瘤切除后可切除小鼠乳腺腫瘤模型的病變情況。

（d）不同處理40天后脾臟組織中T_EM細胞（CD8⁺CD44⁺CD62L^-）的比例。

（e）體內生物發光圖像顯示各種治療方法的抗轉移作用。

（f-g）靜脈注射4T1細胞后21天肺組織轉移灶定量計數及H&E染色切片。

（h）不同治療方法對原位乳腺癌荷瘤小鼠體內生物發光的影響。

（i）具有代表性的CT圖像用于各種治療后乳腺腫瘤骨轉移的可視化。

（j）不同治療方法對原位乳腺癌荷瘤小鼠生存曲線的影響。

圖六、siRNA2@HPVP的治療響應率

（a）CRISPR-Cas9介導的大規模基因突變的Mlh1基因敲除示意圖。

（b）獲得的7個突變細胞系的SNP（左）和Indel（右）分析。

（c）作為Mlh1基因敲除后細胞突變的分析。

（d-h）用aPDL1+PTX或siRNA2@HPVP+PTX靜脈注射治療的5種不同乳腺腫瘤模型的腫瘤生長曲線（左）、腫瘤浸潤性T細胞比例（中）和生存曲線（右）。

（i）弧圖和熱圖顯示每個個體的腫瘤內免疫指標（CD3、CD4、CD8、Foxp3、IL2、T-bet和IFN-γ）。

【結論展望】

綜上所述，制備的含有PDL1封鎖siRNA（siRNA@HPVP）的HPV仿病毒納米粒子，能進行有效的抗癌免疫治療，且具有較高的反應率。siRNA@HPVP通過疫苗和α6整合素對腫瘤細胞的主動靶向作用，顯示了良好的腫瘤蓄積能力。更重要的是，HPVP有效地激活了先天免疫，配合腫瘤的ICB治療。術前siRNA2@HPVP治療證明可減少可切除乳腺癌的術后復發和遠端轉移。在不可切除的腫瘤模型中，與臨床使用的治療方案相比，siRNA2@HPVP還延長了無進展生存和總體存活率。此外，當結合PTX的化療，siRNA2@HPVP在一系列異基因腫瘤模型上表現出優異且穩定的治療反應率，優于III期臨床試驗（aPDL1加PTX）的治療。臨床使用的疫苗和ICB之間的這種結合可能會成為目前的癌癥療提供新的方法。

文獻鏈接：A vaccine-based nanosystem for initiating innate immunity and improving tumor immunotherapy (Nat. Commun., 2020, DOI: 10.1038/s41467-020-15927-0)

課題組簡介：

張先正，博士，教授，武漢大學博士生導師，長江學者特聘教授、國家杰出青年基金獲得者、國家“萬人計劃”科技創新領軍人才、享受國務院政府特殊津貼。國際生物材料科學與工程學會聯合會(IUSBSE) Fellow、英國皇家化學學會Fellow (FRSC)、中國生物材料學會青年科學家獎獲得者、科技部中青年科技創新領軍人才。

張先正教授長期從事生物醫用高分子/多肽的研究，包括腫瘤診斷與治療、藥物傳遞、基因治療等，研究成果獲教育部自然科學一等獎1項、二等獎1項、湖北省自然科學一等獎1項。已在Nat. Biomed. Eng.、Prog. Polym. Sci.、Nat. Commun.、Sci. Adv、Adv. Mater.、JACS、Angew. Chem. Int. Ed.、Nano Lett.、ACS Nano、Adv. Func. Mater.、Biomaterials、Small等期刊發表SCI論文500多篇，其中IF大于10的160多篇。論文SCI他引17000多次，H因子70。2015年-2019年連續入選中國高被引學者榜單（材料科學）。參與撰寫學術專著4部（共4章）。申報國內外專利20余項。擔任中國生物材料學會理事會常務理事，中國生物材料學會醫用高分子材料分會副主任委員、中國材料研究學會高分子材料與工程分會常務理事，中國化學會高分子學科委員會委員等。Materials Today Chemistry 主編、Materials Today、Molecular Pharmaceutics、中國科學-化學、高分子學報、化學學報、功能高分子、高分子材料科學與工程、膠體與聚合物等國內外期刊編委等。

課題組網站：http://xzzhang.whu.edu.cn/index.html

本文由大兵哥供稿。

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