Science：景觀分析高效篩選PET水解酶

一、【科學背景】?

聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一種廣泛使用的塑料材料，因其耐久性和廣泛的應用而難以自然降解，導致嚴重的環境污染問題。近年來，科學家們致力于開發能夠有效降解PET的酶，即PET水解酶（PETases），以實現塑料的生物回收利用。

盡管已有一些PET降解酶被發現，例如來自細菌Ideonella sakaiensis的IsPETase酶和葉堆肥角質酶（LCC），但這些酶的降解效率和工業應用潛力仍有限。此外，自然界中可能存在更多具有PET降解能力的酶，但目前缺乏有效的方法來識別和評估這些酶的潛力。因此，本文旨在通過一種新的方法——景觀分析框架，來系統地評估和篩選具有PET降解能力的酶，以期發現更高效、更具工業應用潛力的PET降解酶。

二、【創新成果】

近日，韓國研究人員開發了一種基于自然序列聚類框架的景觀分析方法，用于評估和篩選具有PET降解能力的酶。該方法通過構建一個包含170個聚類和1894個節點的語義網絡，涵蓋了已知的大多數PETases。通過兩輪篩選，研究者發現了三個具有高PET降解潛力的酶系譜（C3、C25和C158），并從中識別出兩種具有高活性的PET降解酶：Mipa-P和Kubu-P。這些酶在PET分解速度和耐久性方面表現出色。研究者對Mipa-P和Kubu-P進行了理性工程改造，生成了Mipa-PM19和Kubu-PM12變體。特別是Kubu-PM12，在高底物負荷和工業條件下的PET降解性能超過了現有的工程基準酶。

圖1 PETase候選物的景觀分析和分析程序。使用指定搜索范圍內的種子序列準備酯基塑料水解酶（EPH）庫。景觀方法如下進行：成對距離計算、鄰域分析和布局。分別使用分層和聚類抽樣在圖上進行初篩和復篩，以追蹤該蛋白家族的適應度景觀。TPA，對苯二甲酸；MHET，單(2-羥乙基)對苯二甲酸；BHET，雙(2-羥乙基)對苯二甲酸。? 2025 Science

本文采用了一種基于自然序列聚類框架的景觀分析方法來評估和篩選具有PET降解能力的酶。首先，研究者從GenBank數據庫中檢索了25,418個非冗余序列，通過PSI-BLAST搜索使用種子序列構建初始序列庫。接著，利用Wilbur和Lipman的距離矩陣方法進行成對距離計算，并通過鄰域分析模塊控制網絡的嚴格性，生成一個包含170個聚類和1894個節點的語義網絡。然后，使用Cytoscape軟件的Prefuse force-directed-cl布局算法將序列映射到二維拓撲結構中，以便全面展示序列之間的關系。最后，通過分層抽樣和聚類抽樣方法，從構建的景觀中選擇代表性節點進行實驗驗證，以評估其PET降解活性和熱穩定性。這種方法為系統評估大量酶的適應度提供了有效的工具和框架，有助于發現和工程化具有工業應用潛力的PET降解酶。

圖2 PETase候選物的景觀分析。每個節點代表一個特定的天然序列（節點總數為1894）。根據在30°C下平均PET降解活性對測試節點進行著色，邊緣以淺灰色顯示。三個未探索的聚類用綠色旗幟突出顯示，兩個強效PETases Mipa-P和Kubu-P用箭頭指示并用節點編號標記。基準節點用箭頭指示并相應標記。? 2025 Science

圖3 PETase篩選。(A) 使用分層抽樣進行PETase初篩。從PET釋放可檢測單體的節點和活性可忽略的節點分別用灰色和黑色圓圈表示。活動數據的標準差（SD）以條形圖表示。熔點（T_m）值用圓圈表示，與相應的Boltzmann T_m值用條形圖連接表示。IsPETase、LCC和三個未探索聚類中的節點按圖中所示的顏色方案著色。(B) 使用聚類抽樣進行PETase復篩。C3、C25和C158中的節點在活性-T_m圖上顯示。八個合格節點被標記，初篩中的代表性節點通過標記形狀和在標簽中添加星號來區分。陰影代表節點之間的邊緣連接。IsPETase和LCC之間的連接線用虛線表示。(C) 三個未探索聚類的網絡。圖的繪制方式與圖2相同。合格節點用實線箭頭指示，初篩中未被選為合格的節點用虛線箭頭指示。? 2025 Science

圖4 Mipa-P和Kubu-P與基準物的比較。(A) Mipa-P和Kubu-P的初始速率和降解程度與基準物進行比較。在30°至70°C的溫度范圍內測量酶的時間過程活性。初始速率對應于3小時的表觀速率，并用灰色虛線及其值表示。從非線性擬合使用四點邏輯模型導出的1小時初始速率值也在括號中標記（星號表示非加權擬合，因為加權模型未收斂）。 (B) 酶的初始速率（3小時）和降解（Depol。）程度（168小時）沿溫度變化。酶的初始速率和降解程度排名沿溫度變化的雷達圖也顯示出來。從1到5的排名用指向中心的軸表示。? 2025 Science

圖5 Mipa-PM19和Kubu-PM12的性能。(A) Mipa-PM19和Kubu-PM12的晶體結構。結構以灰色卡通模型顯示，催化三聯體用黃色球體模型突出顯示。相對于起始蛋白序列的突變用洋紅色棒模型區分并標記。(B) Mipa-PM19和Kubu-PM12與其野生型對照物的比較。鏈接圓圈或交叉圖表示通過單體釋放（HPLC采樣）或酯鍵斷裂（NaOH消耗）計算的降解程度。(C和D) 酶在高底物負荷條件下的降解性能。以20%（C）和30%（D）的PET負荷進行的生物反應器操作如圖5B所示繪制。每個反應的最終重量損失也以白色圓圈顯示。? 2025 Science

Mipa-P和Kubu-P是兩種具有PET水解活性的酶，分別來源于Micromonospora pattaloongensis和Kutzneria buriramensis。通過對這兩種酶進行理性設計和突變工程，研究人員開發出了Mipa-PM19和Kubu-PM12這兩個變體。Mipa-PM19和Kubu-PM12在熱穩定性方面顯著提高，Mipa-PM19的熔點（T_m）達到了92.4°C，比野生型提高了24.1°C，而Kubu-PM12的T_m甚至超過了99.9°C，無法在常規溫度范圍內測量。此外，這兩種變體在PET水解速率和程度上也表現出色，特別是在高溫條件下，Mipa-PM19和Kubu-PM12的初始水解速率和最終水解程度都高于其野生型版本。在工業相關的高底物負荷條件下，Kubu-PM12表現出卓越的性能，能夠在70°C下快速水解PET。

圖6使用KubuPM12進行酶催化PET乙二醇解。(A) 酶催化乙二醇解和在脫酰化步驟的反應機制的示意圖。在乙二醇（EG）溶劑下，PET和EG都可以作為酶的變性劑和底物。(B) 通過在EG中預孵育對三種酶的酶催化PET乙二醇解活性和失活模式進行比較。1天反應后BHET、單(2-羥乙基)對苯二甲酸（MHET）和可忽略的對苯二甲酸（TPA）的摩爾分數以甜甜圈圖顯示。(C) 在生物反應器規模上使用Mipa-PM19和Kubu-PM12進行酶催化PET乙二醇解。溫度條件如（B）中標記。? 2025 Science

該研究篩選出兩種具有高活性的PET降解酶：Mipa-P和Kubu-P，對Mipa-P和Kubu-P進行了理性工程改造，生成了Mipa-PM19和Kubu-PM12變體，Kubu-PM12在工業條件下的表現尤為突出，能夠在高底物負荷和乙二醇作為溶劑的條件下進行PET的酶催化水解，生成雙(2-羥乙基)對苯二甲酸酯（BHET）作為主要產物，濃度可達數十毫摩爾。以“Landscape profiling of PET depolymerases using a natural sequence cluster framework”為題發表在國際頂級期刊Science上，引起了相關領域研究人員熱議。

三、【科學啟迪】

綜上所述，本文通過開發一種基于自然序列聚類框架的景觀分析方法，系統地評估和篩選了具有聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）降解能力的酶。研究者構建了一個包含170個聚類和1894個節點的語義網絡，涵蓋了已知的大多數PET降解酶。通過兩輪篩選，發現了三個具有高PET降解潛力的酶系譜（C3、C25和C158），并從中識別出兩種具有高活性的PET降解酶：Mipa-P和Kubu-P。進一步的理性工程改造生成了Mipa-PM19和Kubu-PM12變體，其中Kubu-PM12在高底物負荷和工業條件下的PET降解性能超過了現有的工程基準酶。這些發現不僅為PET的生物降解提供了新的酶資源，還為工業應用中PET的回收利用提供了潛在的技術支持。

原文詳情：Seo, H., Hong, H., Park, J., Lee, S. H., Ki, D., Ryu, A., Sagong, H.-Y., & Kim, K.-J. (2025). Landscape profiling of PET depolymerases using a natural sequence cluster framework. Science, 387(6701), eadp5637. https://doi.org/10.1126/science.adp5637

本文由景行撰稿