Nano Lett.：氟化低聚乙烯亞胺納米組裝體因其有效的內涵體逃逸可實現血清環境下高效的基因沉默
【引言】
小干擾RNA（siRNA）介導的基因治療已被認為是多種先天性和惡性疾病的一種頗具前景的治療方法。為提高該體系在特定組織的沉默效率，目前已開發出包括重組病毒和合成載體兩大類基因載體。盡管重組病毒表現出非常高的siRNA遞送效率，但是由于其潛在的免疫原性、致癌性以及不易大規模制造等困難，很大程度上阻礙了其在臨床中的應用。相比起來，合成載體（如陽離子聚合物和脂質體）則具有免疫原性低、易于合成和修飾等優勢。但是，合成載體在含有蛋白質的生理環境里的基因遞送能力卻會大打折扣。因此，迫切需要開發能夠在生理環境中仍然具備高效遞送能力的合成載體。近年來，基于全氟化碳的合成基因載體成為基因遞送領域的明星載體，主要是因為它們能夠在含有血清的培養基中維持高效的基因遞送能力。然而，對于全氟化碳基因載體的這種獨特出眾的基因遞送能力的深入探究目前鮮有報道。
【成果簡介】
近日，國家納米科學中心梁興杰研究員、廣州醫科大學郭偉圣教授與天津大學邢金峰教授合作，制備了一系列全氟辛酰氯修飾的氟化低聚乙烯亞胺化合物，所得到的納米復合物能夠實現細胞內高效的siRNA遞送。含血清培養基中的基因沉默實驗表明，納米復合物在Luc-HeLa細胞中實現了88.4%的熒光素酶沉默，其沉默效率約為商用載體Lipo 2000的2倍。這項工作不僅提供了一種新型、高效的siRNA載體，而且還對氟化基因載體在有血清條件下的基因遞送行為和抗血清機制做了深入探究。為研究氟化基因載體的抗血清機制，作者開發了兩種烷基化載體：aOEI-C8和aOEI-C12，分別與氟化載體具有相同的分子結構和相似的疏水段疏水性。細胞水平的基因沉默結果顯示，兩種烷基化載體在血清存在下的基因沉默效率均大幅下降，而氟化載體仍能保持較高的基因沉默效率。該結果說明氟化載體的抗血清基因遞送能力不能簡單歸因于其分子結構或分子疏水性。接下來，為尋求氟化載體和烷基化載體抗血清能力差異的原因，作者研究了它們在有、無血清下的細胞內吞和內涵體逃逸行為。結果顯示，烷基化載體在血清存在條件下，其細胞內吞效率雖然有所提高，但其內涵體逃逸能力顯著性降低；而氟化載體能夠在血清存在條件下仍然保持高的內涵體逃逸效率。該結果說明氟化載體的抗血清基因轉染能力的主要原因之一是其在血清存在下所保持的較高的內涵體逃逸能力。然后，作者進一步對納米組裝體的抗蛋白吸附能力以及血清蛋白對納米組裝體穩定性的影響進行了研究。該結果說明即使氟化載體在血清蛋白存在條件下所保持的較高的內涵體逃逸能力是得益于其優異的抗蛋白吸附能力，從而使得其在血清環境里仍然能夠保持良好的穩定性和質子緩沖能力。此外，體內實驗結果顯示氟化載體能夠更加安全有效地沉默小鼠肝部ApoB蛋白的表達，從而降低小鼠血液低密度脂蛋白含量。該成果以題為"Fluorinated Oligoethylenimine Nanoassemblies for Efficient siRNA-Mediated Gene Silencing in Serum-Containing Media by Effective Endosomal Escape"發表在國際著名期刊Nano Letters上。該論文的第一作者是天津大學張廷斌博士和北京理工大學黃淵余教授。
【圖文導讀】
圖1 fxOEI NAs的合成與表征
(a) fxOEIs、fxOEI NAs以及fxOEI NAs與siRNA復合物制備的示意圖；
(b) fxOEI NAs以及fxOEI NAs與siRNA復合物的TEM形貌圖片；
(c) 瓊脂糖凝膠電泳法測定fxOEI NAs的siRNA壓縮能力。
圖2 fxOEI NAs的體外siRNA轉染
(a) 不同氟化度納米組裝體在穩定表達熒光素酶的人宮頸癌Luc-HeLa細胞中的基因沉默測定；
(b) 比較OEI、Lipo 2000以及f0.7OEI NAs在有、無10% (v/v) FBS條件下沉默HeLa細胞中的GFP的能力；
(c) 比較OEI、Lipo 2000以及f0.7OEI NAs在有、無10% (v/v) FBS條件下沉默HeLa細胞中的PLK1的能力。
圖3烷基化和氟化NAs的物理化學性質和基因沉默效率
(a) aOEI-C8、aOEI-C12和f0.7OEI的化學結構；
(b) aOEI-C8 NAs、aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs在有、無siRNA負載時的TEM形貌圖片；
(c) aOEI-C8 NAs、aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs的臨界膠束濃度和ζ電位值；
(d) 通過MTT法測定f0.7OEI、aOEI-C8和aOEI-C12的NAs/siRNA納米復合物在不同NAs濃度下的細胞毒性；
(e) 比較aOEI-C8 NAs、aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs在Luc-HeLa細胞中遞送針對熒光素酶siRNA的效率。
圖4 血清蛋白對烷基化和氟化NAs遞送的siRNA細胞攝取和內體逃逸的影響
(a) 利用流式細胞儀測定aOEI-C12 NAs/siRNA和f0.7OEI NAs/siRNA在與細胞孵育4h后的細胞攝取情況；
(b) 與圖a結果對應的不同組的平均熒光強度；
(c)利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察aOEI-C12 NAs/siRNA和f0.7OEI NAs/siRNA在與細胞孵育8h后的細胞內分布；
(d) 利用Image-Pro Plus 6.0軟件計算Cy5標記siRNA和Lysotracker green的共定位比例；
(e) 氯喹和巴弗洛霉素A1對aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs在有、無10% (v/v) FBS條件下沉默Luc-HeLa細胞中熒光素酶效率的影響；
(f) 利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察aOEI-C12 NAs/siRNA和f0.7OEI NAs/siRNA在有、無氯喹和巴弗洛霉素A1情況下與細胞孵育8h后的細胞內分布。
圖5 血清蛋白對烷基化和氟化NAs穩定性的影響
(a) 通過BCA法測定aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs吸附蛋白質的能力；
(b) 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測定aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs吸附蛋白質的能力；
(c) QCM法比較aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs吸附BSA的能力；
(d) 利用QCM實時測定BSA與aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs的相互作用；
(e) 在有、無10% (v/ v) FBS的培養基中aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs的膠體穩定性；
(f) 在添加FBS之前和與FBS孵化120分鐘后aOEI-C12 NAs (1)和f0.7OEI NAs (2)溶液的圖像；
(g) 血清蛋白在aOEI-C12 NAs和f0.7OEI NAs表面上吸附效率的示意圖。
圖6 負載siRNA的烷基化和氟化NAs的體內分布
(a) 在C57BL/6小鼠中靜脈內給藥NAs后不同時間點的全身圖像；
(b) 在C57BL/6小鼠中靜脈內給藥NAs后不同時間點的離體器官圖像；
(c) 不同時間點不同組樣品在肝部聚集的平均熒光強度；
(d) 給藥10小時后主要離體組織的平均熒光強度；
(e) 給藥30小時后主要離體組織的平均熒光強度；
(f) 給藥72小時后主要離體組織的平均熒光強度。
圖7 用負載抗siApoB的烷基化和氟化NAs處理的小鼠的基因沉默和血清生化
(a) 用PBS、aOEI-C12/siApoB NAs和f0.7OEI/siApoB NAs處理后小鼠肝臟ApoB mRNA水平的測定；
(b) 用PBS、aOEI-C12/siApoB NAs和f0.7OEI/siApoB NAs處理后小鼠血清中CHO水平的測定結果;
(c) 用PBS、aOEI-C12/siApoB NAs和f0.7OEI/siApoB NAs處理后小鼠血清中LDL-c水平的測定結果；
(d) 用PBS、aOEI-C12/siApoB NAs和f0.7OEI/siApoB NAs處理后小鼠血清中HDL-c水平的測定結果;
(e-h) PBS及aOEI-C12/siRNA NAs和f0.7OEI/siRNA NAs在siRNA劑量為1或3 mg/kg組處理小鼠后的血生化分析結果。
【小結】
在本文中，作者開發了一系列氟化低聚乙烯亞胺，其能夠很容易地形成納米組裝體（fOEI NAs），并且能夠在細胞中有效的遞送siRNA。在沒有FBS的情況下，f0.7OEI NAs表現出有效的細胞攝取和內體逃逸，并且即使在FBS存在下也能夠保持這些特性。與烷基化的NAs相比，f0.7OEI NAs在含有FBS的培養基中顯示出良好的膠體穩定性和血清蛋白吸附抗性。此外，與烷基化NAs相比，載有siRNA的f0.7OEI NAs在肝臟中實現了對ApoB表達的有效抑制。
文獻鏈接：Fluorinated Oligoethylenimine Nanoassemblies for Efficient siRNA-Mediated Gene Silencing in Serum-Containing Media by Effective Endosomal Escape?(Nano Lett. 2018, DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b02553)
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