南京大學J. Am. Chem. Soc.:通過酶介導的熒光反應和自組裝實現可激活NIR熒光/ MRI雙模態探針用于體內成像

【引言】

多模態分子成像探針對于生物醫學和臨床研究是至關重要的。例如，磁共振成像（MRI）和近紅外（NIR）熒光協同組合的雙模態成像探針，其中MRI可以產生具有無限組織穿透深度和高空間分辨率的解剖圖像，而NIR熒光能夠產生高靈敏度的圖像。然而，大多數探針顯示“始終在線”信號，可能導致腫瘤-背景比(TBR)較差，還不能有效地滿足早期診斷惡性腫瘤的需求。小分子基可激活探針具有明確的化學結構以及較小的尺寸，使得它們能夠滲透并擴散到腫瘤組織中以達到分子靶并被激活。但是，設計能夠與腫瘤細胞相互作用且可以同時切換NIR熒光和MRI信號的小分子探針仍然具有挑戰性。此外，小尺寸探針可導致從靶位快速沖洗進而降低腫瘤累積和TBR，對長期分子成像是不利的。因此，迫切需要一種新的策略來設計可激活熒光/MR雙模態成像探針以提高其腫瘤滲透性和腫瘤積累。

【成果簡介】

近日，南京大學葉德舉教授課題組設計并合成了一種小分子基可激活NIR熒光/ MRI雙模態探針，并通過酶介導熒光反應和原位自組裝將其用于體內成像。該策略利用酶的催化活性增強了MR特性并增加了靶組織中的探針積累。使用堿性磷酸酶（ALP）作為模型酶，研究表明，可激活雙模態探針能夠實現皮下ALP陽性腫瘤的非侵入、高敏感和空間分辨成像以及NIR熒光引導的原位肝臟腫瘤的實時手術切除。該成果以題為" Activatable NIR Fluorescence/MRI Bimodal Probes for in Vivo Imaging by Enzyme-Mediated Fluorogenic Reaction and Self-Assembly"發表在國際著名期刊J. Am. Chem. Soc.上。

【圖文導讀】

圖1 ALP激活的NIR熒光/MR雙模態探針用于體內成像的示意圖

(a) P-CyFF-Gd的化學結構、ALP介導的熒光反應和P-CyFF-Gd原位自組裝成NPs的示意圖；

(b) 提出的P-CyFF-Gd用于體內ALP陽性腫瘤細胞的NIR熒光/MR雙模態成像的機制；

(c) 設計的非組裝對照探針P-Cy-Gd的化學結構。

圖2 P-CyFF-Gd的體外表征

(a) 與ALP（2 U/mL）在37 °C孵化指定時間后，P-CyFF-Gd（200 μM）的HPLC分析；

(b) 與ALP（2 U/mL）在37 °C孵化指定時間后，P-CyFF-Gd（200 μM）的DLS分析；

(c) 將P-CyFF-Gd（200 μM）與ALP（2 U/mL，37 °C）一起孵化30分鐘后形成納米粒子的TEM和AFM圖像；

(d) 與ALP（0.1 U/mL，37 °C）孵化0-40分鐘，P-CyFF-Gd（5 μM）的紫外-可見吸收光譜；

(e) 與ALP（0.1 U/mL，37 °C）孵化0-40分鐘，P-CyFF-Gd（5 μM）的熒光光譜；

(f) 在Tris緩沖液中與ALP（2 U/mL）孵化0-40分鐘后，P-CyFF-Gd (200 μM)的T₁加權MR圖像和T₁值（0.5 T）；

(g) 用不同濃度的ALP孵化30分鐘后P-CyFF-Gd（5 μM）的熒光光譜；

(h) 與胰蛋白酶、BSA、溶菌酶、ACP、ALP或ALP以及P-CyFF-Gd的抑制劑Na₃VO₄一起在Tris緩沖液中孵化后，P-CyFF-Gd的熒光光譜；

(i) 與胰蛋白酶、BSA、溶菌酶、ACP、ALP或ALP以及P-CyFF-Gd的抑制劑Na₃VO₄一起在Tris緩沖液中孵化后，P-CyFF-Gd的T₁加權MR圖像。

圖3 腫瘤細胞中ALP活性的成像

(a) 與P-CyFF-Gd（100 μM）孵化10-60分鐘的HeLa細胞的NIR熒光成像；

(b) 與P-CyFF-Gd（100 μM）孵化1小時后，固定在HeLa細胞膜上的自組裝納米粒子的典型冷凍SEM圖像；

(c) （b）圖中紅框區域放大的冷凍SEM圖像；

(d) （c）圖中紅框區域放大的冷凍SEM圖像；

(e) 與P-CyFF-Gd（100 μM）孵化1小時后，從活HeLa細胞膜上收集的自組裝納米粒子的TEM圖像；

(f) 細胞沉淀的熒光（上）和T₁加權MR（下）圖像；

(g) （f）圖中細胞沉淀的平均熒光強度（紅色）和T₁值（0.5T，黑色）的比較；

(h) ICP-MS分析Gd含量。

圖4 攜HeLa腫瘤的活體小鼠內源性ALP的雙模態成像

(a) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射在0、1、2、4和8小時小鼠的縱向熒光成像；

(b) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射后，攜HeLa腫瘤小鼠的T₁加權MR圖像；

(c) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射在0、1、2、4和8小時小鼠的歸一化熒光強度；

(d) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射后，攜HeLa腫瘤小鼠的最大信號增強（% SE）；

(e) P-CyFF-Gd（黑色）、CyFF-Gd（藍色）和腫瘤裂解物（紅色）的HPLC跟蹤；

(f) 在注射到小鼠體內4小時后，HeLa腫瘤和主要器官中P-CyFF-Gd（紅色）或P-Cy-Gd（藍色）的生物分布。

圖5 原位肝腫瘤的雙模態成像和熒光引導手術

(a) 正常小鼠和原位HepG2/Luc肝腫瘤異種移植小鼠的全身熒光（下）和生物發光（上）成像；

(b) 原位HepG2/Luc肝腫瘤異種移植小鼠的T₁加權MR成像；

(c) 在肝臟直接噴灑P-CyFF-Gd（10 μM）30分鐘后，成像引導手術切除原位HepG2/Luc肝腫瘤。

【小結】

本文中，作者報道了一種將酶介導的熒光反應與原位自組裝相結合的新策略以設計小分子基可激活NIR熒光/ MRI雙模態探針并將其用于ALP活性的實時體內成像。通過一系列體外和體內實驗， ALP介導的熒光反應和P-CyFF-Gd自組裝成單分散NPs得到實驗驗證。研究表明，鑒于NIR熒光和r₁弛豫率的同時增強，P-CyFF-Gd似乎適合于非侵入性地測量和定位活腫瘤細胞和活小鼠中的ALP活性。此外，P-CyFF-Gd成功應用于術中小鼠原位肝腫瘤邊緣的定位，因而允許實時圖像引導切除肝腫瘤。未來，該策略可用于設計具有NIR熒光和其他成像模態協同組合的可激活探針，以及用于癌癥治療診斷的藥物遞送控制。

文獻鏈接：Activatable NIR Fluorescence/MRI Bimodal Probes for in Vivo Imaging by Enzyme-Mediated Fluorogenic Reaction and Self-Assembly??(J. Am. Chem. Soc., 2019, DOI: 10.1021/jacs.9b03649)

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