浙大劉建釗和唐本忠課題組Chem. Commun.: 通過熒光和質譜聯用的表征方法對細胞內RNA的合成與降解進行可視化和定量分析

【引言】

RNA在調節基因表達中起著至關重要的作用，包括傳遞遺傳信息、感知或傳遞對細胞信號的反應，以及催化生物反應和表觀遺傳修飾。細胞內RNA水平由RNA的合成和衰變兩方面所決定，并受到細胞內控制基因表達模式的嚴格控制。對細胞內RNA代謝動力學的研究可以為細胞內RNA的轉錄和相關疾病的起因提供新的認知和理解。

為了原位研究細胞內的動態過程，如RNA的生物合成與降解，科研工作者開發了代謝標記法。這種利用細胞代謝對RNA進行標記的方法通常使用RNA核苷類似物，比如5-溴尿苷（5-BrU）和5-乙炔基尿苷（5-EU），作為標記試劑，并能夠隨時間跟蹤新轉錄的RNA，而不會干擾細胞的完整性。與經典的核苷相比，這些類似物在結構上略有變化，以確保他們可以通過代謝進入到新合成的RNA中，而不影響堿基配對。一般而言，這些類似物含有或能夠用放射性化合物、抗體或熒光化合物進行后期修飾。對于放射性跟蹤而言，這種方法需要使用危險且價格昂貴的放射性核苷；除此之外，放射自顯影的過程很緩慢，暴露時間長達幾周，并由于信噪比較低而導致分辨率較差。在5-Br-抗體結合的方法中，這個方法涉及繁瑣的細胞培育和洗滌步驟，組織染色還會受到抗體擴散等問題的干擾。與上述方法相比，基于小分子的熒光探測憑借其低成本、響應快、易于檢測、靈敏度高和危害性較低等優點在眾多方法中脫穎而出。例如，基于5-EU代謝標記和使用疊氮化物-炔烴點擊化學的熒光團生物正交修飾的方法，已經用于探索細胞RNA轉錄，然而，該方法所使用的熒光生色團具有較嚴重的光漂白問題，導致其產生的熒光信號在激光掃描下很不穩定，造成較大的量化誤差。

迄今為止，科研工作者已經開發出了很多熒光探針，并成功應用于RNA標記和傳感中，其中一些熒光探針已經商業化。然而，這類探針大多數都表現出ACQ的性質，即分子呈單分子狀態時發光較強，而當分子在聚集態時發光變弱。因此這類分子只能在低濃度的非聚集態使用，又導致了抗光漂白能力較差的問題，限制了其在定量分析測試中的應用。香港科技大學的唐本忠院士課題組在2001年發現了一種與傳統ACQ發光現象截然不同的反應：聚集誘導發光。當分子以單分子狀態溶解在溶液中時，分子幾乎不發光；當分子處于聚集狀態時，發光明顯增強。這是由于當分子處于單分子狀態下時，激發態的能量通過分子內運動以非輻射躍遷的方式耗散掉。當分子發生聚集以后，分子內旋轉和振動受限，激發態的能量只能通過激發態到基態的輻射躍遷完成，從而觀察到發光增強。到目前為止，AIE熒光探針已經被廣泛開發出來，并成功應用于體外和體內生物檢測和成像中，包括生物分子特異性檢測、細胞成像和診療一體化等。與傳統ACQ染料相比，AIE染料具有較大的斯托克斯位移、更強的抗光漂白能力和更強的發射強度等優點。因此，認為AIE探針可以用于RNA合成與降解的定量研究中。

【成果簡介】

近日，浙江大學劉建釗研究員課題組和唐本忠院士課題組合作，合成了炔烴修飾的腺苷，即N⁶-炔丙基腺苷（p⁶A），來標記細胞內新轉錄的RNA。選擇p⁶A作為RNA標記物的原因主要有兩個：一個是p⁶A的化學結構與腺苷非常相似，不影響堿基配對，其炔丙基修飾為熒光標記的后續正交點擊修飾提供了化學基礎；另一方面，腺苷衍生物相對于嘧啶衍生物而言，具有更加優異的檢測靈敏度，可以在質譜中進行RNA的定量檢測。我們合成了具有AIE性質的熒光探針，SO₃-TPE-N₃。探針具有疊氮基團，可以與標記物p⁶A上的三鍵進行點擊反應，使新轉錄的RNA帶上熒光標記。除此之外，SO₃-TPE-N₃的熒光為黃色，可以避免細胞自發熒光的干擾。當探針分子與RNA共價連接時，其分子內運動受限導致熒光強度增加；細胞合成的RNA越多，細胞內的熒光強度就越強。通過結合熒光光譜數據和超高效液相色譜結合三重四級桿串聯質譜（UHPLC-QQQ-MS/MS）表征分析，我們發現熒光信號在特定時間內與細胞內p⁶A含量呈線性關系，使我們對RNA的檢測成為一種定量的方法。這種工作將熒光成像與質譜定量相結合，為生物學研究提供了一種簡單而強大的工具，可用于細胞內RNA生物合成與降解的可視化與定量分析。該成果以題為“Visualization and quantification of cellular RNA production and degradation using a combined fluorescence and mass spectrometry characterization assay”發表在Chem. Commun.上。

【圖文導讀】

Figure 1.在p6A代謝標記的RNA成像中，具有AIE活性的SO3-TPE-N3與商業染料Alexa488-N3的光物理性能的比較

（A,B）濃度為10 μM的Alexa488-N₃和SO₃-TPE-N₃的紫外吸收光譜和熒光發射光譜

（C）分別用SO₃-TPE-N₃和Alexa488-N₃染色后的HeLa細胞，在不同時間間隔激光掃描后，用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像的圖像。激發波長分別為405 nm和488 nm; 比例尺為20 μm；探針濃度為10 μM

（D）在共聚焦激光掃描顯微鏡下記錄的細胞圖像的PL強度與掃描時間的關系

Figure 2.在不同實驗處理條件下，熒光探針標記HeLa細胞內RNA的CLSM圖像

（A-C）將細胞與p⁶A（1 mM）一起培育，然后利用炔-疊氮化物點擊化學用SO₃-TPE-N₃對細胞染色

（D-F）將細胞用p⁶A（1 mM）和轉錄抑制劑放線菌素D（5 μg/ mL）孵育6小時，然后進行與A-C相同的熒光染色方法

（G-I）將細胞與hydrourea（10 mM）一起溫育6小時，并應用相同的染色方法。藍色通道：激發波長：405 nm; 收集波長：420-440 nm; 黃色通道：激發波長：405 nm; 采集波長：520-560 nm。比例尺為20 μm

Figure 3.使用p⁶A代謝標記和SO₃-TPE-N₃熒光成像策略對HeLa細胞中RNA合成過程的研究

（A-L）將HeLa細胞與p⁶A（1 mM）一起溫育0, 2, 4和6小時，然后利用疊氮化物-炔烴點擊化學的方法用SO₃-TPE-N₃對p⁶A標記的細胞進行染色。藍色通道：激發波長：405 nm; 采集波長：420-440 nm; 黃色通道：激發波長：405 nm; 采集波長：520-560 nm。比例尺為20 μm

（M）全細胞熒光強度與不同p⁶A孵育時間之間的函數關系

（N）使用UPHLC-QQQ-MS/MS測定的HeLa細胞中在p⁶A存在下對總RNA p⁶A攝入含量與不同孵育時間的定量分析

（O）p⁶A與細胞培育不同時間后的UPHLC-QQQ-MS/MS測定，檢測通道對于具有質量轉變（306至174）的p⁶A是特異性的

（P）全細胞熒光強度與p⁶A/A的線性相關性

Figure 4.使用p⁶A代謝標記和SO₃-TPE-N₃熒光成像策略對HeLa細胞中RNA降解過程的研究

（A-L）將用p⁶A（1 mM）預處理6小時的細胞與RNA合成抑制劑一起孵育0, 2, 4和6小時，然后利用疊氮化物-炔烴點擊化學的方法用SO₃-TPE-N₃對p⁶A標記的細胞進行染色。藍色通道：激發波長：405 nm; 采集波長：420-440 nm; 黃色通道：激發波長：405 nm; 采集波長：520-560 nm。比例尺為20 μm

（M）全細胞熒光強度與不同RNA合成抑制劑孵育時間之間的函數關系

（N）使用UPHLC-QQQ-MS/MS測定的HeLa細胞中在p⁶A存在下對總RNA p⁶A攝入含量與不同RNA合成抑制劑孵育時間的定量分析

（O）p⁶A與RNA合成抑制劑培育不同時間后的UPHLC-QQQ-MS/MS測定，檢測通道對于具有質量轉變（306至174）的p⁶A是特異性的

（P）全細胞熒光強度與p⁶A/A的線性相關性

【小結】

在這個工作中，我們報導了一種熒光成像與質譜檢測結合的方法用于實現細胞內RNA生物合成與降解的可視化和定量分析。這種方法為生物學研究RNA代謝提供了一種簡單、低成本的方法，可以及時研究原位RNA的動態。標記物p⁶A可以通過代謝進入細胞RNA中，并可以通過質譜定量檢測其含量。除此之外，p⁶A的碳碳三鍵，可以與熒光探針中的疊氮基團進行點擊反應，實現細胞內新合成的RNA的熒光標記。與易于光漂白的商業ACQ探針相比，我們新合成的AIE熒光探針SO₃-TPE-N₃，在生物水環境中具有較高的亮度、優異的光穩定性和較大的斯托克斯位移。通過高靈敏度的質譜定量驗證，我們發現在細胞RNA生物合成和降解過程中的細胞熒光信號與細胞內p⁶A標記的RNA含量呈較好的線性關系。因此，我們認為這種熒光成像與質譜結合的方法可以實現細胞內RNA代謝的可視化和量化。

Visualization and quantification of cellular RNA production and degradation using a combined fluorescence and mass spectrometry characterization assay

(Chem. Commun., 2019, DOI: 10.1039/c9cc03923f)

本文由材料人學術組tt供稿，材料牛整理編輯。?

材料牛網專注于跟蹤材料領域科技及行業進展，這里匯集了各大高校碩博生、一線科研人員以及行業從業者，如果您對于跟蹤材料領域科技進展，解讀高水平文章或是評述行業有興趣，點我加入編輯部大家庭。?

歡迎大家到材料人宣傳科技成果并對文獻進行深入解讀，投稿郵箱tougao@cailiaoren.com。

投稿以及內容合作可加編輯微信：cailiaokefu，我們會邀請各位老師加入專家群。