新加坡國立大學劉斌教授Angew. Chem. Int. Ed.:通過代謝標記實現細胞內細菌病原體可視化和原位清除

【引言】

巨噬細胞通過識別、攝取和消化侵入性細菌病原體，成為抵御細菌感染的第一道防線。然而，特定細胞內細菌的分泌系統可以使巨噬細胞中病原體持續存活。在宿主巨噬細胞中存活，細胞內細菌可免受其他免疫攻擊。在這種情況下，巨噬細胞不僅不能消除細菌，也可能成為細菌繁殖的來源，這可能導致嚴重的傳染病，如結核病。此外，宿主巨噬細胞的屏蔽作用顯著阻礙了細胞內細菌的檢測和消融。這增加了細胞內細菌的行為研究難度，并降低了抗生素對細胞內細菌相關疾病的治療效率。

基于對細菌肽聚糖的成像，生物正交標記已成為用于檢測細菌的有效策略。肽聚糖是重復單元為N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）的交聯網狀體。在細菌與代謝前體溫育后，細菌細胞壁上表達反應性化學基團（例如疊氮化物，炔烴）。隨后引入相應的生物正交基團修飾的熒光團可以通過連接反應有效地標記細菌肽聚糖。由于宿主哺乳動物細胞僅使用一組確定的L-氨基酸進行生物合成，因此引入的D-氨基酸可以特異性地標記細菌的肽聚糖，而不能標記宿主細胞。因此，該策略有望跟蹤宿主細胞中的細菌。不幸的是，由于目前的生物正交反應通常需要兩步操作，甚至可能需要復合催化劑進行連接反應，到目前為止，細胞內細菌的標記過程需要固定感染性宿主細胞或用宿主細胞外的代謝前體預處理細菌。目前沒有可以在活細胞中實現細胞內細菌的實時追蹤的報道，更不用說對細菌進行原位消融。

【成果簡介】

近日，新加坡國立大學劉斌教授課題組成功開發了一種細菌可代謝的雙功能探針TPEPy-D-Ala，它基于D-丙氨酸和一種具有聚集誘導發光特性的光敏劑，用于活體宿主細胞中細胞內細菌的熒光點亮成像和光動力學消融。一旦代謝結合到細菌肽聚糖中，TPEPy-D-Ala的分子內運動被抑制以增強熒光信號，從而提供細胞內細菌的清晰成像。此外，TPEPy-D-Ala可以通過與肽聚糖的共價連接原位有效地消融標記細胞內的細菌，產生20±0.5μg/mL的低細胞內最小抑制濃度（MIC），比通常使用抗生素、萬古霉素更加有效。該成果以題為“Visualization and in-situ Ablation of Intracellular Bacterial Pathogen through Metabolic Labeling”發表在Angew. Chem. Int. Ed.上。

【圖文導讀】

Figure 1.探針分子的光物理性質表征

（a）TPEPy-D-Ala和TPEPy-L-Ala的化學結構和合成途徑

（b）TPEPy-D-Ala和TPEPy-丁炔在PBS中的吸收和熒光光譜

（c）TPEPy-D-Ala在不同THF /醚混合物中的熒光光譜

（d）在PBS中或在與BSA（0.01mg/mL），磷脂（0.01mg/mL），巨噬細胞裂解物和MRSA孵育后在650nm處TPEPy-D-Ala的相對熒光強度;

（e）在不同的白光照射（60mW/cm²）時間下ABDA和TPEPy-D-Ala混合物的吸收光譜

Figure 2.TPEPy-D-Ala在肽聚糖生物合成中的生物成像

（a）探針分子的成像機理示意圖

（b）探針分子對MRSA的熒光成像

（c）探針分子對大腸桿菌的熒光成像

Figure 3.MRSA感染的RAW 264.7細胞的成像

用TPEPy-D-Ala（a）或TPEPy-L-Ala與Hoechst 33342（b）處理的MRSA感染的RAW 264.7細胞的成像

Figure 4.光動力學治療

（a）在光照射下用不同濃度的TPEPy-D-Ala處理細胞內MRSA的CFU

（b）在黑暗條件下或光照射下用不同濃度的TPEPy-D-Ala處理的RAW 264.7細胞的細胞活力

【小結】

在這個工作中，作者開發了一種實時細胞內細菌標記的點亮探針和原位光動力學消融。一旦代謝結合到肽聚糖中，探針可以清楚地追蹤隱藏在活巨噬細胞中的細胞內細菌。在定位這些細胞內細菌后，探針可以在光照射下有效地消融它們。這個工作首次實現了活細胞中細胞內細菌的可視化和消除。作者所開發的策略將有益于細胞內細菌相關疾病的實時檢測和治療。

Visualization and in-situ Ablation of Intracellular Bacterial Pathogen through Metabolic Labeling

(Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201910187)

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