Nature Nanotechnol.：用于監測腦部細胞外K+含量的超靈敏探針

【引言】

細胞外鉀離子濃度([K⁺]_o)變化會影響神經元的膜電位，從而影響神經元活性。同時，[K⁺]_o的改變可能與神經系統疾病有關，例如癲癇和阿爾茨海默氏癥等，因此，選擇性檢測[K⁺]_o可以監測疾病。但是，現有的探針技術不能檢測[K⁺]_o的微小變化，特別是在自由移動的動物中。此外，它們容易受到鈉離子的干擾。在這里，我們報告了一種超靈敏K⁺探針，通過配體表界面自組裝方法，將“三腳架”配體在負載有熒光染料的介孔硅納米粒表面自組裝形成可以篩選出目標離子的薄膜，從而賦予該探針高靈敏性和高特異性，實現癲癇發作的自由移動小鼠大腦中[K⁺]_o變化的動態監測。

【成果簡介】

近日，浙江大學的凌代舜教授、陳忠教授以及首爾大學的Taeghwan Hyeon教授（共同通訊）在Nature Nanotechnology上發表了一篇題為“A sensitive and specific nanosensor for monitoring extracellular potassium levels in the brain”的文章。這項工作報告了一種通過配體表界面自組裝制備超靈敏探針的方法，該離子探針可以監測自由移動小鼠大腦中細胞外離子的動態變化。研究團隊通過合成三維的“三腳架”配體，使其在負載有熒光染料的介孔硅納米粒表面自組裝形成對不同離子具有選擇性的薄膜，制備得到新型離子探針。其中，利用K⁺選擇性薄膜孔中存在的六個羰基氧原子及孔徑與K-O鍵鍵長相近的特征，實現了對K⁺的特異性篩選，隨之捕獲到的K⁺在介孔硅納米粒孔道內富集，增強了該探針檢測K⁺的靈敏度。基于該探針，首次在自由活動的生命體中實現了非侵入性的實時動態的腦部神經活動監測。

【圖文導讀】

圖1 K⁺探針的原子級設計和性能表征

a，K⁺探針的設計示意圖。K⁺指示劑載入MSN中。MSN表面的K⁺選擇性薄膜僅允許K⁺進入；

b，K⁺選擇性薄膜中“三腳架”配體的化學結構示意圖；

c，捕獲K⁺后，K⁺選擇性薄膜的化學結構示意圖：K原子，紅色；C原子，灰色；O原子，綠色；N原子，藍色；

d，K⁺探針的TEM圖；

e，沿d中白線的EDS元素線掃描揭示了元素分布并證實了K⁺探針的結構；

f，該圖顯示了K⁺探針在中性環境下對150 mM [K⁺]具有高度選擇性。然而，在酸性或堿性環境中觀察到熒光強度略有下降。添加其他生理陽離子后，熒光強度沒有明顯變化。ΔF＝ F-F₀，其中，F是給定離子濃度下的熒光強度，F₀是0 mM [K⁺]下的熒光強度；

g，[K⁺]從0增加到150 mM以及從150減小到0 mM時K⁺探針的熒光強度變化；

h，在富含K⁺（150 mM [K⁺]）和不含K⁺（0 mM [K⁺]）的水溶液中孵育20個循環的K⁺探針的熒光強度變化。在達到平穩之前的前六個循環中，每次循環熒光強度略有減少；

i，在富含K⁺和不含K⁺的水溶液中孵育時，K⁺探針熒光強度隨時間的變化結果。

圖2 K⁺探針高選擇性和高靈敏度的機理研究

a，在去離子水中K⁺和Na⁺水合層的示意圖；

b，c，左邊，分散在含K⁺和Na⁺溶液中的未覆蓋K⁺選擇性薄膜的探針（b）和K⁺探針（c）的TEM圖像。右邊，沿著TEM圖像中白線的EDS元素線掃描結果；

d，在c中用白色虛線框標出區域的EDS元素映射，如白色箭頭所示；

e，K⁺選擇性薄膜腔與K⁺/ Na⁺之間相互作用的示意圖：除去水合層后，K⁺與孔中的氧原子相互作用，這在能量上有利于K⁺的通過。但是，Na⁺無法與孔中的氧原子充分相互作用，這在能量上不利于粒徑較小的Na⁺的通過；

f，K⁺/Na⁺通過K⁺選擇性薄膜時，薄膜與K⁺/Na⁺之間的結合能計算結果。?

圖3 培養的神經元中K⁺釋放的成像

a，在aCSF中對藥理調節K⁺釋放的海馬神經元進行成像的實驗設計圖；

b，首先將培養的海馬神經元與各種傳感器預孵育。暴露于Coriaria內酯后，K⁺探針的熒光強度增加，而未覆蓋K⁺選擇性薄膜的探針和游離指示劑未觀察到顯著變化；

c，在通過微通道連接的兩室微腔中培養的被K⁺探針標記的神經元的CLSM圖像，胞體和軸突分離在兩個隔間中；

d，從小鼠海馬體處記錄的EEG數據，虛線所示范圍為放大圖；

e，在與5 μM海藻酸孵育前后，c中兩個選定區域的熒光強度變化結果；

d，當海藻酸的濃度增加至10 μM時，熒光強度變化結果。

圖4?大腦切片中K⁺釋放的成像

a，對急性背側紋狀體腦切片中電刺激誘發的K⁺釋放進行成像的實驗設計圖；

b，在不同強度的給定電脈沖下細胞外熒光響應結果（右），紅點表示信號響應（?F/F₀）大于5％的區域；

c，對b中峰值熒光響應的變化進行量化，結果表明只有K⁺探針能夠靈敏檢測到電刺激腦切片中的[K⁺]_o變化；

d，應用K⁺探針的腦切片熒光圖像；

e，通過K⁺選擇性微電極（藍線）和K⁺探針光學成像（紅線）記錄了電刺激時腦切片中的[K⁺]_o變化。?

圖5 自由移動小鼠大腦中的動態[K⁺]_o波動監測

a，監測電點燃誘發的癲癇小鼠模型中[K⁺]_o動態變化的體內實驗設計圖，其中反復電刺激會增加癲癇發作的嚴重程度；

b，c，同時對不同癲癇發作階段（b，癲癇發作階段3；c，癲癇發作階段5）的小鼠進行神經活動記錄和熒光成像。頂部，癲癇發作時EEG數據及其放大圖。中間，EEG數據對應的能譜。底部，K⁺探針對電點燃誘發的癲癇發作的熒光響應；

d，自由移動的正常小鼠注射了K⁺探針后，沒有熒光反應；

e，癲癇小鼠（癲癇發作階段5）注射了aCSF后，沒有熒光反應。頂部，EEG數據。中間，EEG數據對應的能譜。底部，K⁺探針的熒光響應；

f，g，K⁺探針熒光信號的振幅（f）和持續時間（g）的變化與刺激次數之間的關系；

h，i，K⁺探針熒光信號的振幅（h）和持續時間（i）的癲癇發作階段依賴性變化。

圖6 自由移動小鼠的腦部多位點[K⁺]_o監測

a, 在電點燃誘發的癲癇小鼠的三個不同腦區（海馬體，杏仁核和皮質）同時進行EEG記錄和光學[K⁺]_o動態成像的實驗設計圖；

b，c，海馬體電點燃刺激導致不同程度的癲癇性發作時，（b，癲癇發作期3； c，癲癇發作期5），EEG結果和熒光成像結果均顯示杏仁核和皮層有反應。左圖是癲癇發作期間的海馬體、杏仁核和皮層中記錄的EEG數據及其放大圖。中間，EEG數據對應的能譜。右圖，在癲癇發作的不同階段，三個不同腦區的熒光響應；

d，e，在小鼠大腦的三個不同區域，K⁺探針熒光信號的振幅（d）和持續時間（e）與癲癇發作階段的關系。

【小結】

研究表明，K⁺探針能夠監測自由移動小鼠大腦中[K⁺]_o變化的動力學過程。與只能用于固定樣品中[K⁺]單點測量的侵入性K⁺選擇微電極相比，此納米探針是非侵入性的，可以在較大范圍內傳遞[K⁺]變化的空間信息。此外，還可以進一步開發基于近紅外發射的K⁺探針，用于在全腦成像中精確檢測癲癇灶，從而促進癲癇的診斷和治療，減少不必要的腦部手術。本研究為離子特異性探針的設計和制備提供了一種表界面配體自組裝的新思路，為在自由活動的生命體上探究神經元放電活動開辟了實時動態監測離子濃度變化的新方法，進而開創了一種活體腦部多位點無創成像的新策略，為神經退行性疾病機制、神經沖動與行為關聯等腦部奧秘的探索帶來了曙光。

文獻鏈接：A sensitive and specific nanosensor for monitoring extracellular potassium levels in the brain（Nature Nanotechnology, DOI: 10.1038/s41565-020-0634-4）

本文由水手供稿。

【團隊介紹】

凌代舜，2013年于首爾大學獲得博士學位，之后在IBS擔任資深研究員，于2015年12月在浙江大學成立獨立課題組，擔任PI。經過五年多的團隊發展，已搭建了完善的分子探針和納米藥物研究平臺。團隊充分利用藥學和化學、材料學、醫學以及生物醫學工程等多學科交叉的優勢，致力于通過材料表界面配體改性和誘導自組裝來可控合成高靈敏/特異性的分子探針和納米藥物，進一步結合靶向遞送、分子影像可視化和疾病微環境響應性診療功能放大等先進技術，在神經退行性疾病和腫瘤等重大疾病的早期診斷和高效治療方面取得了系列化顯著成果。相關成果在Nature Nanotechnol.、Nature Mater.、Nature Biomed. Eng.、J. Am. Chem. Soc.、Adv. Mater.、Angew. Chem.、Adv. Funct. Mater.、ACS Nano、ACS Cent. Sci.、Nano Today、Nano Lett.、Mater. Horiz.等國際學術刊物發表論文80余篇。

團隊在該領域部分代表性工作匯總

• Jianan Liu, Fangyuan Li, Yi Wang, Limin Pan, Peihua Lin, Bo Zhang, Yanrong Zheng, Yingwei Xu, Hongwei Liao, Giho Ko, Fan Fei, Cenglin Xu, Yang Du, Kwangsoo Shin, Dokyoon Kim, Sung-Soo Jang, Hee Jung Chung, He Tian, Qi Wang, Wei Guo, Jwa-Min Nam, Zhong Chen*, Taeghwan Hyeon*, Daishun Ling*, A Sensitive and Specific Nanosensor for Monitoring Extracellular Potassium Levels in the Brain, Nature Nanotechnology, 2020, DOI: 10.1038/s41565-020-0634-4
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• Wei Shao, Qiaolin Wei, Shuaifei Wang, Fangyuan Li*, Jiahe Wu, Jiafeng Ren, Fangyi Cao, Hongwei Liao, Jian-Qing Gao, Min Zhou*, Daishun Ling*, Molecular engineering of D-A-D conjugated small molecule nanoparticles for high performance NIR-II photothermal therapy, Materials Horizons, 2020, DOI: 10.1039/C9MH00660E
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