武漢大學張先正Adv. Funct. Mater.: 細菌誘導的腫瘤特異性凝血吸引抗體工程血小板用于檢查點抑制劑免疫治療

【引言】

通常，無序的腫瘤微環境伴隨著缺氧，過營養化和免疫赦免，這可以為細菌，尤其是兼性厭氧菌提供生存空間。因此，細菌非常適合用于準確區分腫瘤組織和正常組織。基于此，各種細菌被創造性地用作抗腫瘤平臺，已被基因改造為蛋白質藥物工廠，或被重塑為用于難治性腫瘤治療的免疫療法疫苗。更重要的是，我們發現低致病性大腸桿菌TOP10除具有靶向腫瘤的能力外，還可以在腫瘤區域而非正常組織中引起快速而強烈的血液凝結。在靜脈注射該細菌后，可觀察到在腫瘤內尤其是未成熟的脈管系統中發生明顯的出血。我們推測這種細菌誘導的凝結（BIC）是由細菌引起的局部炎癥觸發，并進一步造成纖維蛋白沉積和血管破壞。同時，這一腫瘤中由炎癥介導的異常出血和血液凝固可觸發免疫細胞的顯著募集和浸潤，包括T細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞等在內的天然免疫細胞是抵抗腫瘤細胞生長的殺手。然而，腫瘤細胞中廣泛存在的免疫檢查點包括程序性死亡配體1（PD-L1），細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）和CD47等在很大程度上阻礙了免疫細胞對其識別作用，降低了其對腫瘤細胞的殺傷作用。引入免疫檢查點抑制劑可以很好地緩解腫瘤中免疫細胞的免疫抑制。但是傳統的免疫檢查點抑制劑不是腫瘤特異性的，并且可能在正常組織中誘導全身性免疫激活。而細菌能夠精準地在腫瘤中引起血液凝結，突出了腫瘤的特征，并因此而吸引大量的血小板進入腫瘤微環境。基于此，血小板非常適合被抗體工程化，作為在人工誘導的BIC后遞送免疫檢查點抑制劑的天然載體生物材料。

【成果簡介】

由于細菌對腫瘤微環境的特異性靶向能力，細菌可以作為有希望的抗腫瘤平臺。武漢大學張先正教授（通訊作者）發現靜脈內施用大腸桿菌TOP10可在腫瘤組織而不是正常組織中引起快速而強烈的血液凝結。已證明大腸桿菌TOP10可以充當凝血級聯的激活劑，以觸發腫瘤內特異性的血液凝固和炎癥，并在腫瘤中募集大量巨噬細胞。另外，募集的巨噬細胞被證實能夠被細菌壁中的脂多糖由促腫瘤的M2表型極化成具有抗腫瘤功能的M1表型。基于上述發現，進一步制備了由CD47抗體修飾的凝血趨向性血小板，其具有細菌治療的腫瘤的趨向性從而運送CD47抗體精準到達腫瘤區域。實驗結果證明，通過工程化血小板CD47抗體的準確遞送，阻止了腫瘤細胞發出的“不要吃我”信號，從而促進了腫瘤細胞極化M1型表型巨噬細胞的吞噬作用。腫瘤中這種由細菌引發的局部凝血與工程化血小板聯用，可能為準確遞送免疫檢查點抑制劑和促進腫瘤免疫治療找到更多可能的發展方向。該成果以題為“Antibody Engineered Platelets Attracted by Bacteria-Induced Tumor-Specific Blood Coagulation for Checkpoint Inhibitor Immunotherapy”發表在Adv. Funct. Mater.上。

【圖文導讀】

Scheme 1.本研究中的治療過程示意圖

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Figure 1.大腸桿菌TOP10能夠特異性引發腫瘤區域的局部凝血

a）大腸桿菌TOP10在腫瘤區域引發特異性凝血示意圖?b）細菌、滅活細菌和陰性對照組處理后的腫瘤組織的H＆E染色，革蘭氏染色和Masson染色切片?c）腫瘤區域血管的光聲成像?d）細菌和滅活細菌處理后的CT26腫瘤中厭氧血紅蛋白和好氧血紅蛋白的代表性二維光聲成像?e）細菌和滅活細菌處理后的CT26腫瘤中的氧合血紅蛋白飽和度定量 f）細菌、滅活細菌和陰性對照組中CT26腫瘤的凝血因子VII濃度 g）KEGG富集分析鑒定出的參與血液凝固和炎癥功能的差異代謝途徑 h）與血液凝固和炎癥功能有關的不同代謝物的熱圖 i）在不同時間點細菌處理后的CT26腫瘤中TNF-α的濃度 j）在不同時間點細菌處理后的CT26腫瘤中IFN-γ的濃度 k）在不同時間點細菌處理后的CT26腫瘤中IL-1β的濃度 l）在不同時間點細菌處理后的CT26腫瘤中IL-6的濃度 m）在不同時間點細菌處理后的CT26腫瘤中IL-12P40的濃度

Figure 2.大腸桿菌TOP10在腫瘤內實現巨噬細胞的募集和極化

a）細菌治療組和陰性對照組中嗜中性粒細胞，DC細胞和巨噬細胞的代表性流式細胞儀分析和相對定量 b）細菌、滅活細菌和對照組的CT26腫瘤的免疫組織化學染色 c）用細菌、滅活細菌和生理鹽水分別處理的CT26腫瘤中M1巨噬細胞和M2巨噬細胞的代表性流式細胞術分析 d）不同處理對巨噬細胞極化的代表性流式細胞術分析

Figure 3. CD47抗體修飾的工程化血小板的制備

a）通過熒光原位雜交技術標記的大腸桿菌TOP10在肝，腎和CT26腫瘤中的熒光分布。b）細菌處理組和陰性對照組小鼠的肝，腎和CT26腫瘤的革蘭氏染色 c）在不同時間點注射DIR標記的細菌后對攜帶CT26腫瘤的小鼠的體內熒光成像 d）注射DIR標記的細菌?48 h后主要器官和腫瘤的離體熒光成像 e）注射細菌?48小時后，不同器官中細菌菌落的平板涂布計數?f）細菌在腫瘤中引起凝血的可能機制 g）P@aCD47的合成方法和示意圖 h）未活化（+前列腺素E1）和活化（-前列腺素E1）血小板的生物掃描電子顯微鏡圖像 i）裝載有CD47抗體的血小板表面共聚焦顯微鏡圖像 j）血小板表面抗體裝載情況的流式細胞儀分析 k）在注射細菌后不同時間間隔，繼續注射Cy5.5標記的工程化血小板，在CT26荷瘤小鼠中對血小板進行體內熒光成像，評估其靶向凝血部位情況。

Figure 4.在異種移植CT26荷瘤小鼠中的抗腫瘤作用

a）治療CT26異種移植荷瘤小鼠的簡要時間表 b）不同治療后的腫瘤體積 c）不同治療后每只小鼠的個體腫瘤生長動力學 d）不同治療后所收獲腫瘤的代表性照片 e）不同處理后的小鼠腫瘤的體內生物發光成像 f）不同處理后小鼠的血生化與血常規檢查指標 g）不同處理后的小鼠血漿CRP濃度 h）不同處理后的小鼠的血漿PCT的濃度 i）不同治療腫瘤中IFN-γ的濃度 j）不同治療腫瘤中IL-6的濃度 k）不同治療腫瘤中IL-12P40的濃度 l）代表性的流式細胞術分析和不同治療方法的M1巨噬細胞和M2巨噬細胞的定量結果 m）不同治療后腫瘤組織的免疫熒光染色（CD206）

Figure 5.在表達熒光素酶的原位CT26腫瘤小鼠中的抗腫瘤作用

a）攜帶小鼠的原位CT26腫瘤的體內熒光成像（0-24小時）和生物發光成像（36小時） b）DIR標記的細菌的體內熒光成像（0-24小時）和原位CT26荷瘤小鼠不同器官的生物發光成像（36小時） c）經過不同治療的小鼠原位CT26腫瘤的體內生物發光成像 d）不同治療方式的結腸內原位CT26腫瘤的H＆E染色圖像和照片 e）腫瘤組織的免疫熒光染色

【小結】

作者在本文中證實了在靜脈注射大腸桿菌TOP10之后，在腫瘤區域中可以特異性觀察到明顯的凝血現象，并且分別在組織水平，細胞水平和代謝水平驗證了這種細菌誘導凝血的發生。更重要的是，作為重要的吞噬細胞類型之一，已確認大量的巨噬細胞可通過細菌觸發的炎癥募集到腫瘤組織中，并通過細菌壁中的脂多糖（LPS）將其進一步極化為具有抗腫瘤功能的M1表型。但是，腫瘤細胞中CD47的上調可以提供抗吞噬的“不要吃我”信號，從而避免了巨噬細胞的識別。為了阻止CD47和M1類表型巨噬細胞中的信號調節蛋白-α（SIRP-α）之間的相互作用，受血小板趨向于凝血部位的特性，利用細菌特異性引發腫瘤組織內的凝血，從而利用工程化血小板將CD47抗體作為免疫檢查點抑制劑精準遞送到腫瘤細胞表面。通過點擊反應，將CD47抗體修飾到純化的血小板表面，以獲得用于激活巨噬細胞吞噬作用的人工免疫檢查點抑制劑載體P@aCD47。文章證明這種細菌誘導的血液凝結極大地突出了腫瘤的特征，并為人工免疫檢查點抑制劑載體準確地提供了特定的腫瘤定位。這種聯合策略可以極大地啟發腫瘤免疫療法的靶向治療。

文獻鏈接：Antibody Engineered Platelets Attracted by Bacteria-Induced Tumor-Specific Blood Coagulation for Checkpoint Inhibitor Immunotherapy, Adv. Funct. Mater.,?2021, DOI:10.1002/adfm.202009744

本文由材料人學術組tt供稿，材料牛整理編輯。