國家納米科學中心最新Angew：多肽原位自組裝策略用于癌癥免疫治療

【背景介紹】

綜合信號通路控制的生物學活動經常通過蛋白質復合物構象的形成（如炎性小體的組裝）被激活的。研究顯示，這些蛋白質復合物的產生嚴重依賴于其他生化分子的識別和激活，而在生理環境中對蛋白質的組裝狀態進行復制和操控迄今為止依然極具挑戰性。自從國家納米科學中心的王浩課題組在2015年首次報道了生物活性分子的體內自組裝行為后，關于生物活性物質在腫瘤位點的原位和響應性組裝的研究開始得到廣泛的關注。然而，盡管基于體內自組裝建立了酶響應組裝的概念，但自組裝分子靶向控制依然鮮見報道。

【成果簡介】

針對這一挑戰，國家納米科學中心的王浩等人報告了一種可編程多肽分子，其由靶向和自組裝模塊兩部分組成，支持通過靶向受體蛋白而實現的特定、高效的組裝策略。通過綁定細胞膜受體，多肽的構象能夠隨著自組裝活化能的降低而趨于穩定，從而促進肽-蛋白復合物低聚化。 基于此，研究首次設計合成了GNNQQNY-RGD多肽(G7-RGD)，通過識別整合素α_Vβ₃受體來驗證上述自組裝概念的可行性。由于α_Vβ₃的存在，游離G7-RGD的臨界組裝濃度從525 μM減小到33 μM，而由此生成G7-RGD 簇可驅動整合素受體的低聚化。最后, 研究還設計了雙特異性組裝肽antiCD3-G7- RGD，可有效驅動CD3的低聚化以及伴隨的T細胞活化，最終實現T細胞介導的癌癥免疫治療。本文第一作者為Man-Di Wang以及Gan-Tian Lv，研究成果以題為“In Situ Self-Assembly of Bispecific Peptide for Cancer Immunotherapy”發布在國際著名期刊Angew上。

【圖文解讀】

?示意圖一、靶向-招募自組裝策略示意圖

圖一、受體介導的G7-RGD特異性、原位高效自組裝

（a）G7-RGD不同濃度下的ThT熒光強度；

（b）G7-RGD與α_Vβ₃共孵育后的ThT熒光強度；

（c）G7-RGD在反應不同階段的勢能圖；

（d）ThT熒光動力學曲線；

（e）G7-RGD組裝的圓二色曲線；

（f）G7-RGD自組裝的二級結構定量

表一、G7-RGD和α_Vβ₃在反應不同階段的解離常數和吉布斯自由能結合常數

圖二、靶向-招募組裝策略設計及其實驗驗證

（a）G7-RGD和GPMVs共孵育4小時后的共聚焦圖像；

（b）G7-RGD和GPMVs混合后的動力學曲線；

（c）處理條件與（a）相同，共聚焦圖像展現了多肽在細胞膜聚集的熒光強度；

（d）不同時間點的熒光強度統計；

（e）多肽自組裝納米纖維（綠色）的偽彩共聚焦圖像；

（f）NBD-G7-RGD處理的MCF-7細胞的共聚焦圖像

圖三、通過靶向誘導招募的組裝過程

（a）通過招募Cy-G7進行NBD-G7-RGD組裝的示意圖；

（b）Cy-G7（紅色信號）和NBD-G7-RGD（綠色信號）在MCF-7細胞上的共定位；

（c）（b）中白線的歸一化熒光強度

圖四、G7-RGD自組裝調節受體整合素α_Vβ₃的低聚化

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（a）G7-RGD熒光信號的共聚焦圖像；

（b）添加多肽后陽性細胞的NBD熒光流式分析；

（c）NBD表達細胞之間的比較；

（d）表達整合素β₃-EGFP的MCF-7細胞的共聚焦圖像

圖五、G7-antiCD3自組裝調節受體CD3的低聚化

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（a）CD3⁺ T細胞和CD3^- MCF-7 細胞上的G7-antiCD3熒光信號；

（b）流式分析顯示隨著多肽的加入，CD3⁺ T細胞上的NBD熒光信號也得到了加強；

（c）CD3⁺ T細胞和CD3^- MCF-7 細胞中NBD⁺細胞的占比；

（d）由CD3-EGFP轉導的MCF-7細胞的共聚焦圖像

圖六、AntiCD3-G7-RGD作為雙特異性偶聯物激活小鼠T細胞

（a）雙特異性多肽序列誘導T細胞活化；

（b）流式分析測量加入antiCD3-G7-RGD后的NBD熒光信號；

（c）antiCD3-G7-RGD在T細胞膜上聚集形成納米纖維的SEM圖像；

（d）利用antiCD3-G7-RGD刺激后的ELISA測量；

（e）流式分析表達在T細胞表面的CD69；

（f）流式分析表達在T細胞表面的CD44

圖七、靶向招募組裝設計實現T細胞介導的細胞溶解

（a）偽色SEM圖像觀測到活化T細胞（綠色）進攻B16F10黑色素瘤細胞（紫色）；

（b）基于乳酸脫氫酶測量B16F10腫瘤細胞的細胞毒性

上述圖片版權方 ? Wiley-VCH GmbH, Weinheim

【小結】

綜上所述，該工作開發了一種精巧高效的原位自組裝策略。作者認為增強組裝的主要機制源于將多肽固定在目標蛋白上以獲得穩定結構從而降低了組裝活化能。同時研究人員也不排除存在其他機制的可能性，例如有多肽配體結合引起的局部高濃度等。與原序列G7相比，TRA肽G7- RGD的特殊之處在于蛋白質特異性組裝觸發和超低的臨界組裝濃度。此外，整合素α_Vβ₃受體在MCF-7細胞因自組裝而低聚化的行為，可為調節生物功能開辟新的道路，同時靶向-招募組裝策略也在T細胞膜上的CD3蛋白質中得到了驗證，在這一實驗中，除了改善組裝情況外，簇態聚集的CD3還能夠提升T細胞的活化。基于上述結果，antiCD3-G7-RGD這一雙特異性偶聯物不僅能夠促進CD3受體的低聚化，還能發揮T細胞介導的腫瘤細胞溶解作用。 因此，靶向-招募組裝代表了一種極具前景的方法，可擴展已有的自組裝肽工具箱和開發在生物學上操縱受體低聚化的策略 。?

文獻鏈接：In Situ Self-Assembly of Bispecific Peptide for Cancer Immunotherapy, Angew, 2021, DOI: 10.1002/anie.202113649.