卡內基梅隆大學Nat Biotechnol：一種用于擴張顯微術的通用分子錨定策略

一、【導讀】

對生物系統的全面理解需要精確地了解從組織水平到單個生物分子長度尺度上組分的空間排列。而擴張顯微術(ExM)是一種僅使用衍射極限熒光顯微鏡就能實現的納米級成像的技術。ExM以物理和各向同性的方式放大細胞和組織:生物分子共價連接到致密和可溶脹的聚電解質水凝膠上，并在化學處理后在水中彼此遠離。擴張顯微鏡通過物理和各向同性放大嵌入遇水膨脹的水凝膠中的保存的生物標本，使傳統顯微鏡的納米成像成為可能。目前的膨脹顯微鏡方案需要預先用反應性錨定化學物質進行處理，以將特定的標記和生物分子類別連接到凝膠上。簡化這一步驟，將使得擴張顯微鏡的應用更加廣泛。

二、【成果掠影】

卡內基梅隆大學Yongxin Zhao教授描述了一種名為Magnify的策略，該策略使用機械堅固的凝膠來保留核酸、蛋白質和脂質，而不需要單獨的錨定步驟。Magnify可將生物標本放大11倍，并能夠使常規光學顯微鏡上以約280 nm衍射極限的物鏡和有效分辨率約為25 nm的條件下對細胞和組織進行成像，如果結合超分辨率光學波動成像，則有效分辨率約為15 nm。并且在廣泛的生物標本上演示了Magnify，提供了對納米級亞細胞結構的深入了解，比如來自小鼠大腦的突觸蛋白，福爾馬林固定石蠟包埋的人類腎臟中的足細胞足突，以及藥物處理的人類肺類器官中的纖毛和基底體缺陷。相關成果以“Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy”發表在Nature biotechnology上。

三、【核心創新點】

采用一種名為Magnify的策略，Magnify使用水凝膠配方，保留了生物分子的光譜，從而消除了單獨的分子特異性錨定步驟的需要。

四、【數據概覽】

圖1 ?Magnify協議的設計和驗證。?2023 The author(s)

a，Magnify方案。b，Magnify凝膠化學。c, Magnify展開的小鼠腦切片。d，蛋白質水解消化后熒光信號被保留。e，在不同錨定和均質化策略下，FFPE人類腎臟切片(藍色)和PFA固定小鼠大腦切片(綠色)中蛋白質保留的比較。f，在Magnify框架下，不同組織類型的蛋白質保留比較。g，Magnify后免疫染色。h, Magnify可以實現納米級突觸結構的可視化。i，用Magnify測量小鼠大腦中homer-bassoon突觸對的距離。

圖2 Magnify在幾種組織類型中的驗證。?2023 The author(s)

a,b，在×60成像并使用SOFI處理的人類腎臟擴張前圖像示例(a)與在×40使用Magnify拍攝的相同FOV擴張后圖像(b)進行比較。c -e, RMS長度測量誤差作為DAPI (c)， ACTN4 (d)和Vimentin (e)展開前與展開后圖像測量長度的函數。f,g，如a和b所示的人類前列腺圖像示例。h,i, RMS長度測量誤差作為DAPI (h)和ATPIF (i)展開前和展開后圖像測量長度的函數。j-o，在幾種人體組織類型中驗證Magnify。p-r，人體組織的3D圖像示例.

圖3 用Magnify成像生物標本中的蛋白質、核酸和脂質。?2023 The author(s)

a，虛線柱狀圖顯示熱變性緩沖液中脂質保留率隨均勻化時間的變化。b，脂質在完全展開的Magnify處理小鼠大腦的可視化。c，用親脂性染料DiD在Magnify處理的小鼠大腦中顯示線粒體。d, Magnify擴增HEK-293FT細胞高爾基膜的親脂性染色。e, HEK-293FT細胞的Magnify圖像與d相似，但顯示DiD核膜標記。f, Magnify擴張小鼠腦血管的親脂性染色。g，人干細胞來源的肺類器官中細胞外囊泡的電子顯微照片。h，完全擴張的人肺類器官胞外囊泡的雙色Magnify圖像。j，放大g中被框住的區域。k, h內所選細胞外囊泡的三維重建，如藍色虛線框所示。l, k中細胞外囊泡的正交圖。m，人類淋巴結組織共聚焦圖像的3D重建。n，擴展HEK-293FT細胞共聚焦圖像的三維重建。

圖4 使用Magnify顯示內源性熒光團。?2023 The author(s)

a，用Magnify-ProK擴展的小鼠大腦矢狀切片的最大強度投影。b，在a中放大顯示成像場中的框內區域。c，放大b中被框住的區域。d, c合并圖層的三維重建。e，在完全擴張的小鼠皮層中三維重建SST細胞，用Magnify進行擴張，用熱表面活性劑溶液均質。f，放大e中框狀區域，顯示樹突棘上的突觸。g，與e相同樣本的小鼠皮層完全擴張的SST神經元的單z平面。h，放大e中框狀區域，顯示突觸位于SST樹突上。

圖5 Magnify-SOFI顯示了細胞成分的超微結構。?2023 The author(s)

a, Magnify和Magnify - SOFI的比較。b，人干細胞來源的肺類器官纖毛的電鏡圖。c，與b相同類型組織的纖毛共聚焦圖像。d, c纖毛三維重建。e，與b中相同類器官中線粒體的電子顯微照片。f，與e中相同的膨大類器官的線粒體共聚焦圖像。g, e中紅框所示線粒體的正交圖。h，成年小鼠腦室管膜細胞襯里室管膜纖毛和基底的Magnify -SOFI圖像堆棧的最大強度投影。i, h的三維重建。j,k，將i中紅色虛線框所示的單個室管膜纖毛3D圖像放大。

圖6 Magnify -SOFI顯示了細微的納米級藥物誘導變化。?2023 The author(s)

a，正常人干細胞來源的肺類器官中纖毛的電子顯微圖。b，與a相似，只是肺類器官用紫杉醇治療。c, Magnify -SOFI纖毛圖像，與a相同類型的組織。d，與c相似，只是肺類器官用紫杉醇治療。e，帶有突出細根的基部的電子顯微照片。f，與e同類型組織對應的基底體共焦圖像。g，攜帶CCDC39突變的人支氣管基底干細胞來源肺類器官的人干細胞來源肺類器官中纖毛的電子顯微照片。h，與g相似組織中纖毛的Magnify -SOFI圖像。i, Magnify -SOFI圖像(上)和電子顯微照片(下)有和沒有缺陷纖毛的并排比較。j，在正常的、紫杉醇處理的(PAX樣本)和CCDC39突變的人支氣管基底干細胞來源的肺類器官(PCD樣本)中正常和異常纖毛比例的堆疊柱狀圖。

五、【成果啟示】

總之，由于Magnify是一種不依賴于復雜光學的化學策略，它提供了一個靈活的框架，可以適應一系列成像模式，凝膠化學和其他ExM策略。Magnify還可以通過其他模式實現納米級成像，例如受激拉曼散射和各種基于質譜的成像技術。最后，Magnify可以在高含量成像系統中實現，其中可以生成大型數據集，以探索藥物治療和疾病相關變化對培養細胞和組織模型中生物分子納米級配置的影響。

原文詳情：Klimas, A., Gallagher, B.R., Wijesekara, P. et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol (2023).

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01546-1