Nat. Commun.: 單壁碳納米角引發巨噬細胞中蛋白質導致細胞焦亡/凋亡提高納米管的生物相容性

【引言】

單壁碳納米角(SNH)是一種新型的納米碳子，由于其獨特的形態和結構而受到越來越多的關注。單個納米角由一個直徑為2- 5nm、長度為40 - 80nm的由sp2鍵結合的碳原子組成。由于原子排列的相似性，碳納米管是SNH最接近的結構模擬。實際上，SNH繼承了碳納米管(CNT)的物理化學特征，在能量轉換、化學工程、催化劑、燃料電池和電子應用等方面具有很大的潛力。SNH由于其結構特點，在合成過程中沒有使用金屬催化劑，在室溫下可以大量生產，在生物醫學應用中可能比CNT更具有優勢。目前，SNH已被廣泛報道為一個多功能的藥物傳遞平臺，在體內的光聲成像、光熱療法等方面。然而，關于SNH的納米安全性和生物相容性的研究還非常缺乏，更不用說它的分子機制了。另一方面，SNH與CNT的形態學差異很大。對于空心CNT來說，長寬比是影響其納米毒性的關鍵因素，而由于球形結構，SNH在三維立體上近似各向同性。因此，從納米毒性和原理上對這兩種碳納米管進行比較是非常必要的。

【成果簡介】

近日，北京大學的張強教授（通訊作者）等報道了在細胞和分子水平的納米毒性和機制中SNH與CNT之間的差異，從而繪制出由這兩種納米碳化物引起的細胞死亡的全貌。用巨噬細胞作為細胞模型進行研究。將SNH與四種納米管相比較，包括單壁碳納米管和多壁碳納米管(MNT)。首次發現SNH和CNT在細胞攝取、碳管納米誘導的細胞凋亡、壞死、焦亡、細胞因子分泌和蛋白表達、水解酶泄漏、溶酶體應激、膜干擾、與膜蛋白相互作用等多方面存在差異。重要的是，通過多種方法證明SNH比CNT具有更好的安全性和生物相容性。基于蛋白質組學和其他研究，一種關鍵的跨膜蛋白—糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B (GPNMB)被發現可以啟動納米毒性。與CNT組相比，SNH組中較弱的納米-GPNMB的相互作用導致納米膜相互作用的程度降低，溶酶體應激、細胞焦亡/細胞凋亡，最終導致巨噬細胞的低毒性，而壞死性凋亡、鐵死亡、自噬和線粒體滲透性轉移(MPT)依賴性壞死的參與基本被排除。研究成果以題為“Single-walled carbon-nanohorns improve biocompatibility over nanotubes by triggering less protein-initiated pyroptosis and apoptosis in macrophages”發布在國際著名期刊Nat. Commun.上。

【圖文導讀】

圖一、巨噬細胞吞噬吸收的SNH、CNT對比?

（a） 細胞培養后細胞內的碳納米的拉曼光譜圖；

（b） 基于激光反射(LR)信號檢測的五個碳納米的相對細胞吸收比較；

（c） 碳納米孵育后細胞的共焦圖像；

（d） 碳納米培養后細胞內溶酶體的透射電鏡圖像。

圖二、SNH、CNT的納米毒性對比?

（a） MTT法檢測不同碳納米的細胞存活率比較；

（b） LDH釋放研究中檢測到不同碳納米的細胞存活率的比較；

（c） PI標記法測定碳納米細胞的流式細胞分析；

（d） 帶Baf和不帶Baf的碳納米孵育后細胞的共焦圖像；

（e） 基于LDH釋放實驗的不同碳納米的細胞毒性分析。

圖三、SNH、CNT誘導的細胞凋亡和壞死對比

?（a） 不同碳納米孵育后的PARP蛋白質印跡分析；

（b） 不同碳納米孵育后的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1裂解蛋白質印跡分析；

（c） 基于蛋白質印跡分析的集成光密度(IOD)值檢測，定量測定碳納米孵育后細胞中的PARP的解理比；

（d） 基于蛋白質印跡分析的集成光密度(IOD)值檢測，定量測定碳納米孵育后細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的解理比；

（e） 蛋白質印跡分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9在碳納米孵育后的裂解；

（f） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑Z-DEVD-FMK對不同的碳納米的細胞毒性檢測；

（g） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK對不同的碳納米的細胞毒性檢測；

（h） 不同的碳納米造成的死細胞的透射電鏡圖像；

（i） 碳納米孵育后的細胞內ATP檢測；

（j） 不同的碳納米細胞孵育后的細胞外和細胞內HMGB1的免疫印跡分析；

（k） 基于WB成像的IOD檢測中細胞外HMGB1與細胞內HMGB1的定量比率；

（l） 基于Annexin V/PI法測定碳納米孵育后細胞的流式細胞分析；

（m） 細胞凋亡/壞死檢測試劑盒檢測不同的碳納米引起的細胞凋亡和壞死的定量比較。

圖四、SNH、CNT對蛋白表達的影響?

（a） LFQ蛋白組學研究納米碳孵育后細胞蛋白變化的層次聚類分析；

（b） 碳納米處理后，對照組細胞蛋白的維恩圖表達變化超過40%；

（c） 基于富集分析的不同碳納米孵育后上調蛋白的基因功能標注聚類；

（d） 基于富集分析的不同碳納米孵育后下調蛋白的基因功能標注聚類；

（e） 熱量圖顯示了在碳納米孵化后參與部分關鍵細胞過程的改變蛋白的表達比較。

圖五、SNH、CNT引起細胞焦亡的對比?

（a） 碳納米孵育后RIP1和RIP3激酶的蛋白印跡分析；

（b） 添加和不添加RIP特異性抑制劑NEC1的不同碳納米孵育的細胞毒性檢測；

（c） 不同碳納米對半胱氨酸天冬氨酸酶-1裂解的蛋白印跡分析；

（d） 基于集成光密度(IOD)值檢測的半胱氨酸天冬氨酸酶-1裂解的蛋白印跡成像過程中的定量卵裂率測定；

（e） 基于特異性檢測試劑盒的不同納米碳細胞孵育后半胱氨酸天冬氨酸酶-1活性的測定；

（f） ELISA檢測不同碳納米引起的細胞外IL-1β測量；

（g） 基于蛋白質陣列技術的納米碳誘導的細胞外的炎性細胞因子熱圖；

（h-I）不同碳納米的細胞毒性檢測，有無兩種泛焦抑制劑。

圖六、SNH、CNT引起的溶酶體壓力對比?

（a） 細胞內碳納米 (淡綠顏色)與線粒體(紅色)的聯合定位CLSM圖像；

（b） 細胞內碳納米 (淡綠顏色)與溶酶體(紅色)的共定位CLSM圖像；

（c） 利用CLSM測量不同碳納米與線粒體進行共定位的參數；

（d） 利用CLSM測量不同碳納米與溶酶體進行共定位的參數；

（e） 碳納米培養后Bcl-2和Bak的蛋白印跡分析；

（f） 碳納米細胞孵育后細胞內細胞器特異性蛋白細胞色素C(線粒體位置)的分布圖像；

（g） 碳納米細胞孵育后細胞內細胞器特異性蛋白組織蛋白酶B(溶酶體位置) 的分布圖像；

（h-I）不同碳納米與溶酶體膜相互作用的透射電鏡圖像。

圖七、SNH和CNT誘導的細胞死亡機制示意圖?

【小結】

研究了SNH和CNT之間的差異，在一系列的級聯細胞毒性問題中得到了證實，多項研究也證實了在四種已建立的碳納米管上，單壁納米角的安全性和生物相容性得到了改善。首次發現一種轉基因糖蛋白(GPNMB)與碳納米結合并引發毒性事件。SNH和CNT具有明顯的形態特征，在形態和程度上表現出不同的納米蛋白和納米膜相互作用，最終表現出不同的納米毒性。有趣的是，這種納米碳誘導的細胞毒性的差異基本上依賴于它們的單一結構單元的幾何形狀，而不是它們在介質或細胞內濃度中的分散形式。

文獻鏈接：Single-walled carbon-nanohorns improve biocompatibility over nanotubes by triggering less protein-initiated pyroptosis and apoptosis in macrophages（Nat. Commun., 2018, DOI: 10.1038/s41467-018-04700-z）

本文由材料人生物材料組小胖紙編譯。

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