武漢大學張先正團隊 ACS Nano: 酶驅動嵌合肽靶向細胞膜用于增強腫瘤的光動力免疫治療

【背景介紹】

最近幾十年里，通過光敏劑（PSs）、光和氧氣產生高細胞毒性的活性氧（ROS）殺死腫瘤細胞的光動力療法（PDT）已成為一種新興的抗腫瘤策略。ROS會不可逆地氧化并破壞鄰近的生物分子，從而破壞細胞的正常代謝和生理活性。但是ROS的壽命短且活性半徑非常有限，因此在ROS失去活性前將其輸送到所需區域非常重要。目前已報道的細胞核、線粒體、細胞膜（PM）等亞細胞靶向策略能顯著增強PDT的抗腫瘤效果。此外，也有研究報道PDT能通過誘導腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡（ICD）來引發抗腫瘤免疫應答。眾所周知，腫瘤細胞的ICD過程會伴隨著損傷相關分子模式（DAMPs）的表達和釋放，DAMPs主要包括鈣網蛋白（CRT）、ATP和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）。DAMPs可作為免疫原性信號來激活抗腫瘤免疫響應。然而，DAMPs在細胞凋亡過程中釋放緩慢，傳統的細胞質PDT（CP-PDT）通過細胞凋亡方式誘導的免疫原性也遠遠低于細胞壞死誘導的免疫原性。因此，通過靶向并破壞細胞膜來誘導細胞壞死的方式能有效促進DAMPs的快速釋放并提高死亡細胞的免疫原性。此外，PDT的抗腫瘤效率也會影響腫瘤相關抗原的呈遞和抗腫瘤免疫反應的激活。這種高效的細胞膜靶向PDT策略通過誘導DAMPs的快速釋放能激活強大的抗腫瘤免疫響應，在免疫治療領域具有重要的意義。

【成果簡介】

近日，武漢大學張先正教授（通訊作者）團隊報道了一種蛋白法尼基轉移酶（PFTase）驅動的細胞膜靶向嵌合肽PpIX-C₆-PEG₈-KKKKKKSKTKC-OMe（PCPK），用于PM靶向光動力治療（PM-PDT）以及通過誘導腫瘤細胞PM損傷和損傷相關分子模式的快速釋放（DAMPs）來增強免疫治療。PCPK靶向PM的能力來源于細胞內K-Ras信號轉導，該信號通路能通過PFTase將相應的蛋白靶向驅動到PM上。結合光敏劑原卟啉IX（PpIX），PCPK可以產生ROS使細胞膜表面相關蛋白失活，從而引發脂質過氧化，并在光照射下以極低濃度（1 μm）破壞PM。特定的PM損傷進一步誘導了細胞內DAMPs的快速釋放，導致抗腫瘤免疫反應的強度比常規的CP-PDT更強。這種免疫激活的PM-PDT策略在聯合程序性細胞死亡的PD-1阻斷治療時展現了較強的轉移瘤抑制作用。研究成果以題為“Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy”發表在國際著名期刊ACS Nano上。

【圖文解讀】

圖一、靶向細胞膜（PM）的PDT（PM-PDT）結合PD-1檢查點阻斷療法根除原發腫瘤并抑制遠端腫瘤的示意圖

圖二、PCPK和PCPK-SR納米顆粒的表征
（A-B）PCPK和PCPK-SR的分子結構及其嵌合肽納米粒子的自組裝過程；

（C-D）PCPK和PCPK-SR納米粒子的TEM圖像；

（E-F）PCPK和PCPK-SR納米顆粒在水溶液中的粒徑分布；

（G）在DMF溶液中PpIX和在PBS中PCPK-SR和PCPK的UV-vis吸收光譜；

（H）通過檢測530 nm處DCF的熒光強度來測定660 nm光照射下PBS、PCPK-SR、PCPK和PCPK與維生素C的ROS生成效率，；

（I）有無660 nm光照射下，利用ROS敏感的熒光探針DCFH檢測PCPK和PCPK-SR的4T1細胞中細胞內ROS產生量。

圖三、研究PCPK和PCPK-SR的細胞PM靶向和滯留
（A）PCPK在細胞內的法尼基化過程和PM靶向作用的示意圖；

（B）PCPK-SR無法進行細胞內法尼基化過程和PM靶向作用的示意圖；

（C-D）PCPK和PCPK-SR與4T1細胞共培養后的熒光圖像和相應的熒光強度分布圖；

（E-F）4T1細胞與PCPK和PCPK-SR共培養8 h并替換為新鮮培養基后，在不同時間點通過共聚焦顯微鏡觀測細胞內熒光的示意圖；

（G-H）在不同時間點替換新鮮培養基后，用PCPK和PCPK-SR處理的4T1細胞的熒光圖像和相應的熒光強度分布圖。

圖四、體外細胞毒性和PM損傷評估
（A）用MMT法測定PCPK和PCPK-SR有無光照下的細胞毒性；

（B）通過MDA法測定對4T1細胞進行多種處理后的脂質過氧化程度；

（C-D）細胞的活/死染色和臺盼藍染色；

（E-F）凋亡壞死染色。

圖五、4T1細胞免疫激活研究
（A-B）通過ELISA和ATP試劑盒檢測細胞上清液中的HMGB-1和ATP的含量；

（C-D）小鼠血清中的IL-6和TNF-α檢測；

（E）體內DC成熟檢測；

（F）體內成熟DC的定量分析；

（G）腫瘤阻止HMGB1免疫熒光染色。

圖六、4T1荷瘤小鼠的體內抗腫瘤研究
（A）PCPK介導的PM-PDT聯合抗PD-1免疫療法抑制原位瘤和遠端瘤的示意圖；

（B-C）在2周評估期內采用不同治療方法后，原位瘤和遠端瘤的相對腫瘤體積；

（D）在2周評估期內4T1荷瘤小鼠的體重；

（E）治療后第14天的原位瘤和遠端瘤的腫瘤圖像；

（F-G）原位瘤和遠端瘤的H＆E和TUNEL染色圖像。

圖七、體內免疫激活研究
（A）4T1荷瘤小鼠遠端瘤的腫瘤浸潤性T淋巴細胞的檢測；

（B）4T1荷瘤小鼠遠端瘤的腫瘤浸潤性T淋巴細胞的定量分析；

（C）4T1荷瘤小鼠遠端瘤組織顆粒酶B免疫熒光染色；

（D）紅色熒光顆粒酶B的MFI值。

【小結】

綜上所述，作者報道了PFTase驅動的腫瘤細胞PM靶向的嵌合肽PCPK用于PM-PDT和免疫激活。通過體外和體內實驗證明，對比PCPK-SR介導的CP-PDT，PCPK介導的PM-PDT的抗腫瘤效果有著顯著的提高。此外，通過免疫分析進一步證實了PCPK介導的PM-PDT將引起DAMPs的快速釋放，從而誘導比CP-PDT更強的系統性免疫反應。結合免疫阻斷劑PD-1，可以檢測到較強的抗腫瘤免疫反應，并有效抑制轉移性腫瘤。總之，該工作報道的高效細胞PM損傷和快速DAMPs釋放的PM-PDT策略可以顯著提高PDT效率并引發抗腫瘤免疫反應，在抗腫瘤的免疫治療方面具有巨大的應用潛力。

文獻鏈接：Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy. (ACS Nano, 2019, DOI: 10.1021/acsnano.9b04315)

本文由CQR編譯。

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