Nat. Rev. Chem.：帶你了解低溫儲存技術的前世今生！

一、【導讀】

溫度對酶的活性有很大影響，大多數酶的適應活動溫度為30~40℃。高溫可使酶蛋白變性、酶鈍化，低溫可抑制酶的活性，但不使其鈍化。在細胞儲存領域，細胞和生物制劑的低溫存儲可以保證從常規樣本存儲到新興的基于細胞的治療的所有生物醫學研究，并確保細胞庫提供經過認證的、穩定的和一致的細胞產品，例如種子樣本、卵母細胞、精子以及新冠疫苗的存儲及運輸。這一領域始于60年前甘油和二甲亞砜作為低溫保護劑的發現和廣泛應用，然而這些工具并不適用于所有細胞，而對于難度較大的組織樣，低溫儲存技術應用難度更大。

二、【成果掠影】

2022年月18日，Nature Reviews Chemistry以題為“Chemical approaches to cryopreservation”在線刊發了英國華威大學Matthew I. Gibson教授關于化學低溫儲藏的綜述。在這篇綜述中，Gibson教授重點介紹并批判性地回顧了發現和應用冷凍保存的新化學工具的方法，并總結了蜂窩冷凍保存過程中的損傷途徑以及如何解決。隨后還討論了以生物為靈感的低溫儲存方法。研究人員描述了基于小分子和大分子的策略，包括冰粘合劑、冰核、冰核抑制劑和新興材料，然而其確切機制尚未得到了解。最后，研究人員還包括探討該領域的未來發展，包括自下而上的分子建模的應用和基于程序庫的發現方法以及材料科學工具等。

三、【核心創新點】

低溫存儲的化學發展是新興的領域，其未來研究方向主要有：

1、開發新的化學工具來應對低溫儲存的挑戰，并厘清細胞低溫儲存損傷機制、細胞類型和冷凍方法之間存在微妙的差異。

2、研究極端條件下微生物并應用，研究特定機制（生化和生物物理）用于推動該領域的發展。

四、【論文掠影】

圖一、低溫保存過程中細胞損傷的潛在機制

當細胞冷卻以進行低溫儲存時，以及在重新加溫期間，會出現一些挑戰。在冷卻過程中，細胞外冰晶的形成導致細胞膜滲透不平衡，導致細胞脫水。在沒有細胞外冰晶的情況下，樣品可能在平衡冰點以下過冷，導致致命的細胞內冰晶形成。快速冷卻速度和添加高濃度低溫保護劑（CPAs）可以實現玻璃化，即無定形無冰晶狀態。然而，高濃度的CPAs可能對細胞有毒。在升溫過程中，冰晶可能發生再結晶，冰晶生長并導致機械損傷和細胞溶解。玻璃化樣品可能變得不穩定和脫玻璃，導致進一步的冰晶生長。最后，冷凍可以誘導細胞凋亡，導致解凍后細胞延遲死亡。注意，這些都是極端情況，不一定同時發生，可以通過添加低溫保護劑來部分緩解。

圖二、玻化冷凍劑

為了實現玻化，樣品必須冷卻以獲得玻化、無定形狀態，沒有異質（外來顆粒）或均質（隨機排列的水分子）冰晶成核。（a）具有不同濃度的冷凍保護劑的水樣樣品的相圖；（b）已研究中和毒性的小分子結構：二甲基亞砜（DMSO）、尿素和甲酰胺；（c）大分子化合物，如聚乙烯醇-聚醋酸乙烯酯共聚物（PVA-co-PVAc）和羧基化ε-聚賴氨酸（COOH-εPLL），已用于限制升溫過程中樣品的脫玻化作用。

圖三、冰晶重結晶抑制劑

（a）冰晶的重結晶是指由小冰晶生長為大冰晶，是Ostwald熟化的一種形式。

（b）冰重結晶抑制劑（IRI）是減緩冰晶生長的分子，常見的IRI分子及抑制能力對比。

圖四、用于低溫儲存的大分子冷凍保護劑

用于低溫儲存保護的冷凍保護劑：（a）混合電荷聚合物；（b）聚合物CPAs；（c）海藻糖聚合物；（d）細菌胞外多糖FucoPol。

圖五、冰晶成核的控制

低溫儲存樣品通常在異質冰成核（由外來粒子的存在催化形成冰晶）發生之前過冷到溶液的熔點以下。作為一個放熱過程，冰晶的形成導致熱釋放和過冷溶液升溫到接近熔點。熱力學穩定的細胞外冰晶驅動細胞脫水，減少致命的細胞內冰晶形成的機會。在高于零度的溫度下，成核會導致少量的結晶熱（紅線），然后逐漸恢復到設定的冷卻速度（虛線），并需要更多的時間脫水。這通常通過添加冰核器來實現。低溫（過冷度越高，藍線）下的成核導致結晶熱越大，隨后的冷卻速率越高，脫水時間越短，導致細胞內結冰。

圖六、低溫儲存的生化調節途徑

（a）海藻糖、L-脯氨酸和甜菜堿等天然滲透性物質通過調節生化途徑，在低溫下保護生物和細胞方面顯示出了希望。

（b）Rho相關卷曲激酶（ROCK）的活性與失巢凋亡的生化途徑有關，ROCK抑制劑Y-27632對該途徑的抑制對冷凍后的胚胎干細胞有益。

五、【前景展望】

冷凍儲存是生物醫學發現和轉化科學的重要工具。基于DMSO和甘油的開創性貢獻，新的、更先進的細胞/組織模型和療法將需要同樣先進的冷凍儲存工具來保護，最大化恢復功能，并確保冷凍儲存方法與冷鏈需求保持一致。在這篇綜述中，Gibson教授介紹了如何開發新的化學工具來應對低溫儲存的挑戰，還描述了這個多變量問題的復雜性，其中需要解決多種損傷機制，細胞類型和冷凍方法之間存在微妙的差異（慢速和快速）。研究極端條件下微生物并應用它們的溶液（冰結合蛋白）或從它們那里學習開發具有高級低溫保護功能的分子或聚合物，已經引起了人們的極大興趣。為了解決這些挑戰，需要一個真正的跨學科方法，使用結構和進化生物學，合成和計算化學，材料發現和細胞生物學。還需要為感興趣的問題找到合適的材料。例如，在輸給患者之前不能去除的一種新的冷凍保護劑必須符合嚴格的管理和安全參數。相比之下，在上游或基礎研究中使用的低溫保護劑可以更容易地應用和使用。在這個不斷發展的領域中，顯然不能僅僅依靠偶然的發現。因此急需研究特定機制（生化和生物物理）用于推動該領域的發展。

文獻鏈接：Chemical approaches to cryopreservation ( Nat. Rev. Chem., 2022, DOI: 10.1038/s41570-022-00407-4)

本文由賽恩斯供稿。