南京大學黃碩最新Nat. Nanotechnol.：利用工程化的納米孔鑒定核苷單磷酸及其表觀遺傳修飾

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一、【導讀】

RNA修飾在各種生物學過程的調控中起著至關重要的作用，并與許多人類疾病相關聯。然而，直接通過測序鑒定RNA的修飾仍然具有挑戰性。納米孔測序很有前途，但目前的策略因序列解碼而復雜化。酶切核苷單磷酸的序列納米孔鑒定可以同時提供準確的序列和修飾信息。

二、【成果掠影】

南京大學黃碩課題組展示了一種苯硼酸(PBA)修飾的異八聚體恥垢分枝桿菌孔蛋白A納米孔?(MspA)，通過該納米孔可以直接區分經典核苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、N7-甲基鳥苷、N1-甲基腺苷、肌苷、假尿苷和二氫尿苷的單磷酸鹽。機器學習準確率高達0.996。該方法也被應用于microRNA和天然tRNA修飾的定量分析。它適用于檢測各種其他核苷或核苷酸衍生物，并可能為RNA表觀遺傳測序帶來新的見解。相關論文以題為：“Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore”發表在Nature Nanotechnology上。

三、【核心創新點】

  • 本工作表明，以外切測序方式對RNA進行測序是一種不同的策略，該策略可以通過納米孔順序讀取外切核酸酶分解的核苷酸。然而，這需要存在能夠明確識別所有核苷酸及其主要修飾的高分辨率納米孔。
  • 本工作通過報告精度為996的自定義機器學習算法對microRNA和天然tRNA修飾進行定量分析。它適用于檢測各種其他核苷或核苷酸衍生物，并可能為RNA表觀遺傳測序帶來新的見解。
  • 本工作表明，該策略原則上還適用于檢測二磷酸核苷、三磷酸核苷、其他核苷酸修飾、核苷酸糖和核苷藥物，只要其結構上仍保留核糖的順式二醇。

四、【數據概覽】

  • 使用PBA修飾的MspA識別NMP

為了構建異八聚體MspA，本工作分別定制合成了編碼N90C MspA-H6和M2?MspA-D16H6的兩個基因。 兩個基因同時插入 pETDuet-1共表達載體。由一個單元的N90C?MspA-H6和七個單元的M2?MspA-D16H6組成的異八聚體MspA是唯一需要的MspA組裝體，簡稱(N90C)1(M2)7 (圖1a)。(N90C)1(M2)7與其他MspA異構體經高分辨凝膠電泳分離后，進行凝膠提取。隨后，3-(馬來酰亞胺)苯基硼酸(MPBA)與(N90C)1(M2)7的唯一半胱氨酸反應(圖1b)。在1.5?M KCl，10?mM MOPS，pH7.0緩沖液中，通過單通道記錄，在單分子水平上對該反應進行了實時觀察(圖1c)。NMPs由核糖、磷酸基團和核基組成，作為RNA的單體單位。由于核糖中存在順式二醇，NMPs與PBA具有親和力，可能直接被MspA-PBA檢測到。繼續施加+200 mV的跨膜電位。以腺嘌呤單核苷酸(AMP)、鳥嘌呤單核苷酸(GMP)、胞嘧啶單核苷酸(CMP)和尿嘧啶單核苷酸(UMP)四種典型的NMP為分析物(圖1d)。立即觀察到由NMPs引起的連續電阻脈沖(圖1d)。然而，M2 MspA測試時沒有觀察到任何事件，證實位于孔隙收縮處的PBA在NMP傳感事件的產生中至關重要。使用MspA-PBA，脫氧核苷單磷酸(dNMP)無法報告任何事件。這是預期的，因為dNMPs沒有傳感所必需的順二醇結構。本工作還利用MspA-PBA對CMP、UMP、AMP和GMP進行了同時傳感(圖1f)，根據不同的阻塞特性可以直接鑒定不同的NMP身份。據我們所知，在事件分布上沒有任何重疊的典型NMP之間的納米孔區分度以前從未有過報道。

圖1. 使用PBA修飾的MspA區分經典的NMP? 2022 Springer Nature Limited

  • 區分表觀遺傳NMP

據文獻報道，~170個表觀遺傳學NMPs早已被發現。這些表觀遺傳NMPs具有極其微小的結構差異，對直接鑒定提出了極大的挑戰。當表觀遺傳NMPs與MspA-PBA結合時，可以通過直接監測納米孔讀出的事件特征來解決這一挑戰。這里測試了7中主要的表觀遺傳NMPs， 他們涵蓋了甲基化、脫氨、異構化和還原等修飾類型。它們的堿基組成如圖2a所示。表觀遺傳NMPs事件具有明顯不同的阻斷幅度。為了充分對比目前測試的所有NMP，在小提琴圖中顯示了每個NMP的%Ib分布，說明幾乎所有的NMP都已經完全可以通過分析其%Ib來區分，盡管UMP和m5C的事件分布仍然存在一定的重疊(圖2b)。通過繪制包含11個不同分析物NMP結合事件的% Ib與SD的散點圖，生成11個完全獨立的事件種群 (圖2c)。這證實了這種檢測模式可以應用于表觀遺傳NMPs。然而，以前從未報道過利用納米孔同時直接區分如此多的核苷酸修飾。

圖2. MspA-PBA鑒定的表觀遺傳NMP? 2022 Springer Nature Limited

  • 通過機器學習識別NMP

本工作建立了一種機器學習算法來自動識別NMPs。整個訓練過程包括數據集輸入、特征提取和模型建立(圖3a)。數據集中的所有事件都有已知的標簽。利用MATLAB自動提取每個事件的%Ib和SD，形成特征矩陣。對主流模型進行了評估，它們都顯示了令人滿意的驗證精度，表明輸入數據質量較高。具體來說，樸素貝葉斯模型和線性支持向量機(SVM)模型的最高準確率得分為0.996。綜合考慮測試集精度，線性SVM模型表現最優。基于線性SVM模型測試集的混淆矩陣結果如圖3b所示，其中大部分NMP檢測結果的準確率為99%或100%。圖3c中還展示了線性SVM模型生成的決策邊界圖。為了從混合物中顯示事件標識，圖3d展示了包含來自11個不同NMP的事件的代表性電流曲線。從中可以識別不同的NMP類型，并在曲線的上方標注機器學習預測的相應標簽。這有效的幫助了實際測量場景中不同NMP的自動納米孔識別。

圖3. 機器學習輔助NMP識別? 2022 Springer Nature Limited

  • 從甲基化microRNA中檢測表觀遺傳NMP

我們進一步試圖對RNA中表觀遺傳NMP直接檢測（圖4a）。通過S1核酸酶處理，RNA首先被酶分解成NMP，然后被MspA-PBA傳感。觀察到的納米孔事件由先前訓練的機器學習模型識別。應用了兩種已知甲基化位點的microRNA，包括hsa-miR-21和hsa-miR-17。具體而言，hsa-miR-21在位置9處含有m5C，hsa-miR-17在位置13處含有m6C。沒有任何酶處理，hsa-miR-21和hsa-miR-17被MspA-PBA傳感時僅觀察到具有深淺不一振幅的毛刺事件，表明這種傳感機制對模板RNA本身不敏感。為減少甘油對S1核酸酶原液的干擾，采用超濾法對S1核酸酶進行預處理，去除甘油。然后用預處理后的S1核酸酶在23℃下消化microRNA 4?h 。從凝膠電泳結果來看，兩種microRNA均被徹底分解。酶處理產物經超濾除去S1核酸酶。在納米孔檢測中，將hsa-miR-21酶切產物加入cis中，終濃度為100 ng μl-1。圖4b顯示了一個具有代表性的電流曲線，其中觀察到許多NMP結合事件，表明MspA-PBA很好地檢測到了生成的NMP。使用機器學習算法對事件進行識別，所獲得的NMP組成與序列完全一致。為了檢驗其通用性，hsa-miR-17也has進行了相同的檢驗。圖4d展示了hsa-miR-17酶切產物中具有代表性的傳感事件。散點圖結果顯示5個NMP事件分布，分別對應CMP、UMP、AMP、GMP和m6A (圖4e)，與hsa-miR-17的序列組成一致。定量分析顯示，m6A位點個數為1.08，表明hsa-miR-17中僅存在1個m6A位點，也與預期相符。

圖4. 檢測RNA的表觀遺傳修飾? 2022 Springer Nature Limited

  • 從酵母tRNAPhe中檢測表觀遺傳NMP

轉運RNA (tRNA)是一種低分子量RNA，用于連接mRNA序列和氨基酸序列。成熟的tRNA還包含豐富的化學修飾。據報道，已在tRNA中發現了90多種類型的修飾。因此，它是評估MspA-PBA在鑒定天然樣品表觀遺傳修飾中性能的理想RNA。啤酒酵母苯丙氨酸特異性 tRNA(酵母tRNAPhe)被用作模型RNA以測試其可行性。MspA-PBA原則上可檢測到m2G,m22G、T和Y的單磷酸酯，有望觀察到新的事件簇。但是，由于缺乏相應的純化合物來產生用于訓練的事件，相應的納米孔事件是可檢測的但無法識別的。缺少順式二元醇的Cm和Gm原則上是MspA-PBA無法檢測的。tRNAPhe首先在23°C下用S1核酸酶處理15 h，得到NMPs。根據凝膠電泳結果，證實tRNAPhe已被徹底分解(圖5b)。將酶處理產物超濾膜去除S1核酸酶，并用于后續的納米孔檢測。

酵母tRNAPhe的修飾圖譜結果如圖5c所示。成功檢測出D、ψ、m5C、m7G和m1A，與前期訓練結果和文獻報道一致。觀察到少量m6A事件，可能是來自背景事件。定量分析表明，酵母tRNAPhe中NMP相對組成為17.53 GMP、16.36 AMP、16.19 CMP、12.06 UMP、3.24ψ、2.17 D、1.53 m5C、0.40 m7G、0.37 m1A、0.11 m6A和0.04 I，與實際值相符(圖5d)。還進行了三個獨立試驗，得出了相同的結論，證實了這項技術的重復性。酵母tRNAPhe消化產物中含有事件的代表性電流曲線如圖5e所示。上述結果很好的驗證了MspA-PBA從天然RNA中檢測NMPs及其表觀遺傳修飾的能力。

圖5. 酵母tRNAPhe表觀遺傳修飾的定量檢測? 2022 Springer Nature Limited

五、【成果啟示】

據報道，含有唯一PBA的異八聚體MspA能傳感NMPs。十一種類型的NMP是完全區分的，效果遠優于α-HL或固態納米孔。本工作構建了機器學習算法，報告了0.996的精度。唯一的限制是，當前的傳感策略無法檢測核糖修飾的NMPs，如Cm和Gm。與質譜相比，我們的方法提供了更高的分辨率，特別是在區分RNA位置異構體方面。因此，它更適用于混合和天然樣品的RNA修飾檢測，無需耦合任何色譜分離技術和復雜的數據解釋。該傳感策略也被應用于鑒定天然RNA樣品中酶切的NMPs，表明利用酶偶聯的MspA-PBA進行外切測序的可行性。雖然沒有論證，但這種策略原則上適用于傳感核苷二磷酸鹽類、核苷三磷酸、其他核苷酸修飾、核苷酸糖和核苷類藥物，只要核糖的順式二醇仍然保留。

第一作者：王玉琴,?張善雨, 賈文東

通訊作者：黃碩

通訊單位：南京大學

論文doi：

https://doi.org/10.1038/s41565-022-01169-2

六、【團隊介紹】

本課題組隸屬于南京大學化學化工學院生命分析化學國家重點實驗室、南京大學化學和生物醫藥創新研究院，主要研究方向為單分子生物傳感器件和單分子生物物理，同時兼顧面向理解生命過程的化學本質的基礎研究和具有實用意義的新型醫療診斷器件的研發。課題組PI黃碩教授長期從事單分子生物物理和單分子納米孔測序技術的新儀器，新方法研究，先后師從于Stuart Lindsay?教授（亞利桑那州立大學教授，Agilent?公司Molecular Imaging創始人） 和Hagan Bayley教授 （牛津大學教授，英國皇家科學院院士，Oxford Nanopore創始人）并在Nature Nanotechnology, Angewandte Chemie International Edition, Chemical Science, Nano Letters, Journal of Physical Chemistry C, Nanotechnology等高水平期刊發表多篇論文，其中以第一作者身份發表Nature Nanotechnology雜志兩篇，并有國際授權專利2項，均轉讓于國際知名企業。于2015年7月加盟南京大學生命分析化學國家重點實驗室開展獨立課題研究。自2015年7月入職南京大學，擁有獨立實驗室2間，細胞間1間，約計160平。現有博士后1人，博士研究生8人，碩士研究生5人，本科生1人，共計14名學生，經過六年多的實驗室建設,已完成實驗室的儀器搭建及團隊的組建工作，科研工作有序開展。 近一年來共計發表高水平論文達17篇，其中包括Nature Nanotechnology 1篇、JACS 2篇、Angewandte Chemie?3篇、Nature Communications 2篇、Nano Lett 2篇、ACS Nano 1篇等。獲得國家級重大人才工程A類（青年項目）、國家自然基金、江蘇省“雙創人才”項目、江蘇省“雙創團隊”項目、江蘇省“杰出青年”基金、中央高校基本業務費等經費資助。

七、【團隊在該領域的工作匯總】

本課題組在發展過程中逐漸形成四個主要的研究方向，包括納米孔測序、單分子化學、生物大分子結構解析和納米孔成像。

在納米孔測序方向，本課題組提出了一種新型且通用的納米孔測序方法即錯位測序方法（Nanopore-Induced Phase-Shift Sequencing，NIPSS）。利用生物納米孔測序體系中的錯位效應，首次實現了針對非天然核酸FANA（Chem. Sci., 2019, 10, 3110），miRNA（iScience, 2020, 23, 100916）和多肽的直接測序（Nano Lett., 2021, 21, 6703–6710）。其中, 多肽的納米孔測序方法亦獲得了《科技日報》的專訪報道，在國內外獲得了廣泛的關注。

針對大分子的結構解析，本課題組巧妙利用MspA納米孔一頭大一頭小的結構特點，以“半阻孔”檢測策略回避了改造整體結構寬大的生物納米孔的需要，對RNA（Nat. Commun., 2021, 12, 3368）和多種蛋白質（Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 23863–23870;?JACS,?2022,144, 757–768）實現了單分子分析。

在單分子化學方向，本課題組首次通過改造內腔結構更加錐形的MspA納米孔實現了納米孔單分子化學檢測性質的大幅優化，提出了采用MspA納米孔單分子反應器的新方向（Nat. Commun., 2019, 10, 5668; Chem. Sci., 2020, 11, 879-887）。進而采用核酸工程替代蛋白質工程，提出了一個全新的納米孔單分子反應器構建策略，并將該技術命名為Programmable Nano Reactor for Stochastic Sensing（PNRSS）（Nat. Commun., 2021, 12, 5811），可以實現孔道內任意化學反應的構建。通過更深度的蛋白質改造，本課題組實現了世界首個異質MspA的構建，進而實現了核酸表觀遺傳學修飾（Nat.?Nanotechnol.，?2022, DOI:10.1038/s41565-022-01169-2）、單糖(Angew. Chem. Int. Ed., 2022，DOI:10.1002/anie.202203769)和糖醇?(JACS, 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c04595) 的單分子檢測。

本課題組以光替代電的思路，通過檢測熒光標記擴散驅動的過孔鈣離子流，開創了首個無需電極的納米孔單分子分析技術（DiffusiOptoPhysiology，DOP），并且成功運用于小分子，有機高聚物，生物大分子的單分子檢測，將單分子檢測成本降低至10元（Sci. Adv., 2019, 5, eaar3309）。

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